中国汉族人脂联素基因rs2241766及rs1501299多态性与2型糖尿病及代谢指标的关系

汝颖，叶山东，胡红琳，陈明卫，王佑民，王长江

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院内分泌科，合肥230001;2.安徽医科大学第一附属医院内分泌科)

·内分泌疾病专题·

中国汉族人脂联素基因rs2241766及rs1501299多态性与2型糖尿病及代谢指标的关系

汝颖1，叶山东1，胡红琳2，陈明卫2，王佑民2，王长江2

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院内分泌科，合肥230001;2.安徽医科大学第一附属医院内分泌科)

目的 在中国汉族人群中，观察脂联素基因rs2241766(T＞G)和rs1501299(G＞T)多态性与2型糖尿病及胰岛素抵抗的关系。方法 使用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染技术结合基因直接测序法，对糖耐量正常(NGT)者150例及2型糖尿病(T2DM)患者285例，进行基因的检测及代谢指标的观察。结果 rs2241766 TT、TG、GG基因型和rs1501299 GG、GT、TT基因型，在T2DM组及NGT组中的分布存在显著差异。rs2241766 G(TG+GG)等位基因携带者患T2DM的风险增加2倍，而rs1501299 TT携带者患T2DM的风险下降;偏相关分析显示，rs2241766 G(TG+GG)等位基因与HOMAIR呈现正相关，rs1501299 TT基因型与HOMAIR呈现负相关;rs2241766 G携带者以及rs1501299 TT携带者的体质量指数(BMI)、腰臀部(WHR)、体脂百分比(%body fat)显著升高。结论 rs2241766 G是中国汉族人 T2DM的危险因素，而rs1501299 TT则是保护因素。

糖尿病，2型;胰岛素抵抗;脂联素;基因;多态现象，遗传;危险因素;汉族

脂联素在糖脂代谢的调节中均起重要作用，它能够促进脂肪酸的氧化以及糖的利用，降低血糖及血脂。因此，脂联素水平降低或不足能够导致胰岛素抵抗的发生，增加2型糖尿病(T2DM)的风险、恶化代谢相关的临床指标。脂联素基因的变异则可能会引起血浆脂联素水平的改变，进而引起临床代谢特征以及T2DM患病风险的改变。为此，我们观察了在中国汉族人中，脂联素基因的rs2241766(T＞G)和rs1501299(G＞T)单核苷酸多态性与T2DM以及胰岛素抵抗的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象 采用2000年1月2001年4月安徽医科大学第一附属医院健康检查、社区健康检查以及门诊糖尿病筛查者，共435名无亲缘关系的安徽地区汉族人，根据1999年WHO诊断标准，分为正常糖耐量(NGT)者150例，年龄34～72(52.7± 8.9)岁，男68例、女82例，体质量指数(BMI)为(25.01±3.07)kg/m2;T2DM患者285例，年龄38～76(53.5±8.7)岁，男 130例、女 155例，BMI (25.66±3.02)kg/m2。排除甲状腺功能亢进症、库欣综合征以及影响糖代谢的其他系统性疾病。

1.2 方法

1.2.1 临床指标 隔夜空腹10 h后，口服75 g葡萄糖于0及120 min取静脉血测定相关指标。以空腹血糖(FPG)及空腹胰岛素(FIns)值推算稳态模式胰岛素抵抗指数［HOMA-IR=(FPG×FIns)/22.5］及胰岛β细胞功能指数［HOMA-β=20×FIns/(FPG -3.5)］，以估测胰岛β细胞胰岛素分泌功能及外周组织对胰岛素的敏感性，体脂百分比(%body fat，男性为1.2×BMI+0.23×年龄-16.2，女性为1.2×BMI+0.23×年龄-5.4)、腰臀比(WHR)、BMI，用于评估体脂含量及分布。

1.2.2 PCR扩增 PCR引物如下:rs2241766正义引物5＇-GGCTCAGGATGCTGTT GC-3’，反义引物5＇-AAGTAGTGTCTGGAGGATGT-3’;rs1501299正义引物5＇-TGAGAAAGGAGATCCAGGTA-3’，反义引物5＇-CACGGCGCTCTTGGTTCTGAA-3’(上海基康公司合成)。PCR反应体系:10×缓冲液5 μl，4×dNTP 1 μl，正反义引物各1 μl，TaqDNA聚合酶2.5 u，DNA模板300 ng，ddH2O补足50 μl。PCR反应条件: 94℃预变性1 min，94℃变性1 min，57℃退火40 s，72℃延伸30 s，31个循环后72℃延伸5 min。

1.2.3 SSCP分析及DNA序列测定 配制6%浓度聚丙烯酰胺凝胶，10 μl PCR产物，加入10 μl甲酰胺变性液和4 μl 6×DNA上样缓冲液，97℃水浴10 min，冰上骤冷。于4℃，75 V稳压电泳后，经固定、脱色、银染、显影、拍照后，干胶处理。将不同带型的PCR产物纯化后，直接进行基因测序(大连宝生物公司)。

1.3 统计学处理 判读带型后，计算各组基因型频率及等位基因频率，以Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。采用SPSS 10.0软件进行分析，组间频率比较采用Pearson卡方检验，组间比较采用独立样本t检验，并进行回归分析及相关分析。

2 结果

2.1 脂联素基因rs2241766及rs1501299基因型及等位基因分布 根据SSCP带型判读并归类后，各基因型DNA直接测序如图1，基因分布如表1。NGT组中rs2241766及rs1501299基因型频率分别为:TT 59.8%、TG 35.5%、GG 5%以及GG 48.9%，GT 41.8%，TT 9.2%。两位点在两组中的基因型分布均达到Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05);两位点间具有高度的连锁不平衡(D’=-0.910)。在NGT组及 T2DM组中，rs2241766(P=0.002 and P= 0.001)及rs1501299(P=0.002 and P=0.001)基因型以及等位基因的分布均差异有统计学意义; rs2241766的G等位基因在NGT组的分布频率高于T2DM组(33.9%vs.22.7%)，rs1501299的T等位基因在NGT组的分布频率低于T2DM组(22.3% vs.30.1%)(表1)。多因素Logistic回归分析显示，rs2241766 GG+TG基因型携带者患T2DM的风险较TT型携带者增加两倍(OR=2.068，95%CI 1.368～3.127，P=0.001)，经性别、年龄、BMI校正后差异仍有统计学意义(OR=1.891，95%CI 1.230～2.908，P=0.004);在经性别、年龄、BMI校正后，偏相关分析显示rs2241766 G等位基因与HOMAIR显著正相关(r=0.186，P＜0.01)。rs1501299 TT基因型携带者患T2DM的风险较GT+GG型携带者显著降低(OR=0.409，95%CI 0.178～0.937，P=0.035)，经校正后OR值为0.442(95%CI 0.188～1.037，P=0.061);偏相关分析显示TT基因型与与HOMAIR显著负相关(r=-0.199，P＜0.01)。

2.2 rs2241766及rs1501299与临床指标的影响T2DM组中，rs2241766不同的基因型携带者的2hPG、SBP、FIns、OGTT两小时胰岛素(2hINS)以及HOMAβ(P＞0.05)差异无统计学意义。TG+GG基因型携带者BMI、WHR、%body fat、FBG以及HOMAIR，较TT基因型携带者显著升高(P＜0.05 or P＜0.01)，而 DBP具有明显的升高趋势(P= 0.055)。在NGT组中，TG+GG基因型携带者较TT基因型携带者的BMI、WHR、%body fat、FIns、HOMAIR显著升高(P＜0.05 or P＜0.01)，FBG有升高趋势(P=0.097)，见表2。

表1 脂联素基因rs2241766及rs1501299在中国汉族人的分布

表2 T2DM组及NGT组脂联素基因rs2241766不同基因型携带者临床指标比较(±s)

表2 T2DM组及NGT组脂联素基因rs2241766不同基因型携带者临床指标比较(±s)

组别 基因型 例数BMI (kg/m2) WHR %body fat FPG (mmol/L) 2hPG (mmol/L) SBP (mmHg) DBP (mmHg) FIns (mIU/L) 2hIns (mIU/L) HOMAIR HOMAβ T2DM 组2 0.309 0.015 0.715 NGT TT 114 24.92±2.86 0.88±0.04 31.33±7.077.81±1.8512.51±4.34 132.17±15.48 82.36±8.75 11.88±7.33 34.24±24.55 1.22±0.60 3.93±0.76 TG+GG 160 25.91±2.98 0.89±0.04 33.41±6.498.35±2.0212.99±4.15 135.18±15.07 84.35±8.13 12.97±8.26 37.07±21.10 1.38±0.50 3.89±0.82 P值 0.006 0.013 0.012 0.026 0.356 0.110 0.055 0.26组TT 84 24.52±3.11 0.87±0.06 31.37±6.644.57±0.43 5.11±1.29 129.20±14.86 80.30±8.20 9.24±3.27 27.59±17.74 0.57±0.32 5.18±0.57 TG+GG 57 25.88±2.76 0.89±0.05 33.82±6.794.70±0.48 5.46±1.16 132.65±13.79 81.96±8.56 11.22±4.24 30.23±20.48 0.78±0.40 5.27±0.55 P值 0.008 0.014 0.035 0.097 0.104 0.166 0.248 0.002 0.416 0.001 0.401

表3 T2DM组及NGT组脂联素基因rs1501299不同基因型携带者临床指标比较(±s)

表3 T2DM组及NGT组脂联素基因rs1501299不同基因型携带者临床指标比较(±s)

组别 基因型 例数BMI (kg/m2) WHR %body fat FPG (mmol/L) 2hPG (mmol/L) SBP (mmHg) DBP (mmHg) FIns (mIU/L) 2hINS (mIU/L) HOMAIRHOMAβT2DM 组0 0.582 0.010 0.389 NGT GG+GT 265 26.07±3.00 0.91±0.08 32.90±7.047.30±1.5913.12±4.00 137.34±15.19 82.93±7.07 12.97±7.75 42.90±25.29 1.28±0.54 4.16±0.67 TT 11 23.84±2.55 0.86±0.06 27.62±6.906.12±1.3810.64±3.19 126.55±10.11 80.45±5.22 10.00±5.19 38.64±20.81 0.85±0.55 4.35±0.88 P值 0.016 0.035 0.016 0.016 0.044 0.020 0.253 0.21组GG+GT 128 25.87±2.66 0.86±0.05 31.42±6.464.60±0.49 5.48±1.22 131.31±10.25 79.96±6.93 10.89±5.14 27.81±9.04 0.69±0.46 5.28±0.64 TT 13 22.94±2.36 0.82±0.05 26.54±7.234.35±0.54 4.98±0.95 125.69±10.36 76.38±7.71 6.47±3.17 21.35±5.54 0.08±0.51 5.15±1.23 P值 0.000 0.012 0.011 0.094 0.161 0.620 0.082 0.003 0.013 0.000 0.524

同时，在T2DM组中，rs1501299 TT基因型携带者与GT+GG基因型携带者相比，其DBP、FIns、2hINS、HOMAβ差异无统计学意义，而 BMI、WHR、%body fat、FIns、2hINS、SBP以及HOMAIR差异有统计学意义;TT基因型携带者具有较低的BMI、WHR、%body fat、FBG、2hPG、SBP以及HOMAIR(P＜0.05 or P＜0.01)。

在NGT组中，与GT+GG基因型携带者相比，TT基因型携带者的BMI、WHR、%body fat、FIns、2hINS、HOMAIR显著降低(P＜0.05 or P＜0.01)，而且，TT携带者的FBG及DBP具有降低趋势，但差异无统计学意义(0.05＜P＜0.10)，见表3。

3 讨论

本研究观察了脂联素基因 rs2241766 T/G和rs1501299 G/T对T2DM的发生、以及一些重要的与代谢有关的临床指标的影响，T2DM患者rs2241766 T/G和rs1501299 G/T基因型以及等位基因分布，与NGT者有显著不同。rs2241766 G等位基因携带者患T2DM的风险增加近2倍，而rs1501299 T等位基因却是T2DM的一种保护性因素;偏相关分析也提示rs2241766 G等位基因与反映胰岛素敏感性的指标HOMA-IR正相关;而rs1501299 T等位基因与HOMA-IR负相关。rs2241766 G等位基因(TG+ GG)携带者与野生型携带者相比，其BMI、WHR、%body fat、FBG、HOMA-IR以及血压明显升高，而rs1501299 TT突变基因型却显示出相反的作用。从这些结果可以看出，rs224176 G等位基因以及rs1501299 T等位基因与胰岛素敏感性的变化密切相关。另外，多因素 logistic回归分析显示，rs2241766 GG+TG基因型、rs1501299 TT基因型携带者患T2DM的风险以及与HOMAIR的相关性，经BMI校正后有一定改变，提示BMI也参与了胰岛素敏感性的改变，这种现象可能归因于脂联素在糖脂代谢中的双重作用［1］。

不同地区和人群的研究发现，脂联素基因的单核苷酸多态性与脂联素的水平、胰岛素的敏感性以及T2DM的关系并不一致。与本文结果相似的是，在日本人中的研究发现rs2241766 G等位基因与脂联素水平的降低以及 T2DM的风险增加密切相关［2］，同样，在德国人［3］、西班牙人［4］中可见类似的结果。但在法国人［5］、加拿大人［6］以及美国人［7］中，却发现rs2241766 T等位基因与胰岛素抵抗的风险增加相关。rs1501299多态性的研究结果同样显示出不一致性，在日本人［2］、西班牙人［4］中的研究结果与本文相一致，G等位基因携带者具有胰岛素抵抗的临床特征且患T2DM的风险增加;但在意大利［8］以及加拿大［9］中，rs1501299 T等位基因携带者却与降低的脂联素水平以及高T2DM患病风险相关。目前这种不同人种中的研究结果不一致的原因尚不明确，但这恰印证了在不同人种中，脂肪细胞因子基因的变异与蛋白浓度以及胰岛素抵抗关系不同［10］。

rs2241766 T/G是一种不改变氨基酸序列的同义突变，而rs1501299 G/T位于内含子中，且远离基因的剪接位点，这两种单核苷酸多态本身并不能够改变脂联素的血浆浓度。有研究已经证实这两种多态性与rs266729和rs17300539存在连锁不平衡，后两者存在于脂联素基因5’端的启动区，能够引起脂联素基因的表达和血浆中浓度的改变［5］。由于在不同人种中rs2241766和rs1501299等位基因及基因型频率不同，会导致连锁不平衡结构发生改变，这可能是不同人种中研究结果不一致的主要原因之一。另外，T2DM是一种高度异质性的多基因疾病，同时又受到环境因素，以及比如吸烟、高脂饮食、缺乏锻炼等行为的影响［11］;这些因素也会对不同人种中脂联素基因单核苷酸多态性与T2DM患病风险相关性产生影响。

(本文图1见封三)

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The association of between the polymorphisms of the adiponectin gene rs2241766 and rs1501299 and the metabolic traits of type 2 diabetes in Han Chinese

RU Ying*，YE Shan-dong，HU Hong-ling，CHEN Ming-wei，WANG You-min，WANG Chang-jiang(*Department of Endocrinology and Metabolism，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001，China)

Objective To investigate the impact of the single nucleotide polymorphisms rs2241766(T＞G) and rs1501299(G＞T)in the adiponectin gene on type 2 diabetes mellitus(T2DM)and insulin resistance in Han Chinese volunteers.Methods Genotypes of 150 subjects with normal glucose tolerance(NGT)and 285 subjects with T2DM，who were Han Chinese residents of the Anhui region，were investigated by using the PCR-SSCP silver staining technique，combined with direct sequencing.Results Significant differences were observed in the frequency distribution of the TT，TG and GG genotypes of rs2241766 and the GG，TG and TT genotypes of rs2241766 between the subjects with T2DM and those with NGT.The G(TG+GG)allele of rs2241766 showed a 2-fold higher risk of T2DM compared with the TT genotype.The TT genotype of rs1501299 showed a lower risk of T2DM compared with the G allele.The partial correlation analysis indicated that the G allele of rs2241766 was positively related to HOMAIR，while the TT genotype of rs1501299 was negatively related to HOMAIR.Carriers of the rs2241766 and rs1501299 risk genotype have some features of insulin resistance.Conclusion The G allele of rs2241766 contribute to the genetic risk of T2DM，but the TT genotype of rs1501299 is a potentially protective factor of T2DM in the Han Chinese population.

Diabetes mellitus，type 2;Insulin resistance;Adiponectin;Genes;Polymorphism，genetic;Risk factors;Han nationality

R587.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.001

2012-02-10)

国家青年自然科学基金(81000321);安徽省高校自然科学基金(KJ2010B385)

汝颖，博士，主治医师，E-mail:ruying2@gmail.com