荔枝酒酿造过程中氨基酸的变化*

沈颖，刘晓艳，2，白卫东，2，赵文红，2，钱敏

1(仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州，510225)

2(华南农业大学食品学院，广东广州，510642)

荔枝酒酿造过程中氨基酸的变化*

沈颖1，刘晓艳1，2，白卫东1，2，赵文红1，2，钱敏1

1(仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州，510225)

2(华南农业大学食品学院，广东广州，510642)

利用高效液相色谱法(HPLC)对不同发酵温度的荔枝酒酿造过程中氨基酸含量的动态变化进行了分析研究。结果表明，荔枝汁和荔枝酒中均含有丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸、丝氨酸等14种氨基酸，其中，丙氨酸是荔枝汁和荔枝酒中的主体氨基酸，含量分别达1139.682 mg/L、341.049～412.161 mg/L。不同发酵温度的荔枝酒酿造动态过程中，其游离氨基酸的种类和含量变化较大，且变化趋势各异。不同贮藏方式对荔枝酒中氨基酸含量和种类影响也不同。通过比较，发酵温度12℃优于15℃，发酵温度为15℃的荔枝酒中氨基酸含量在贮藏过程中变化幅度较大，不稳定，且影响风味的氨基酸较多。

荔枝酒，氨基酸，HPLC，发酵，动态变化

荔枝果酒是以野生或人工种的荔枝为原料发酵而成的低酒精度饮料，保留了水果原有的糖类、氨基酸、有机酸和矿物质等成分。以荔枝全汁酿制的荔枝酒含有丰富的维生素、有机酸及含氮物质，且保留了荔枝特有的风味成分，既有陈酿的香味，又有水果原有的芳香，深受人们的喜爱。目前荔枝果酒产业的发展潜力已被人们所认知，但是发展的步伐很慢，主要是因为荔枝果酒的风味不佳，口感淡薄、尖酸、具有一定的苦涩感。而荔枝酒的风味是衡量荔枝酒品质的一个重要指标。其风味成分十分丰富，主要有醇类、糖类、氮类、酸类、挥发性香气物质、酚类物质及其他成分，且不同品种的荔枝酒所含的风味成分也不尽相同[1］。

氨基酸是荔枝酒中的主要风味物质，直接影响酒的口感品质，氨基酸本身除了呈现酸、甜、苦、鲜等各种味道，如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等呈现甜味，谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺呈鲜味，色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸呈苦味，为荔枝酒提供了丰富饱满的感官特征外，还与酒中的醇类、酯类、有机酸、羰基化合物和萜烯化合物等协同构成了荔枝酒的特有风味，并赋予了荔枝酒较高的营养价值[2-3］。本研究利用HPLC检测了荔枝原酒和不同发酵方案酿制过程中荔枝酒氨基酸含量的变化，初步探讨了荔枝酒中氨基酸形成的原理，以期为荔枝酒风味物质的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

高效液相色谱仪，安捷伦1100，Agilent Technologies;氨基酸分析柱，4.6 μm×150 mm 5-Micron，Agilent Technologies。

1.2 试剂

氨基酸混标 1nmol/μL(Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Cys、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys)、衍生剂(OPA、FMOC)以及硼酸盐缓冲溶液，均为安捷伦科技有限公司色谱纯产品;NaOH、NaH2PO4(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);乙腈、甲醇均为瑞典欧谱生高效液相色谱纯产品。

1.3 测定方法

1.3.1 样品前处理

取荔枝酒20 mL，3600 r/mim于25℃下离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，待测。

1.3.2 色谱条件

流动相A:pH 7.8 NaH2PO4缓冲溶液(0.04 mol/L);流动相 B∶V(乙腈，ACN)∶V(甲醇)∶V(水)=40∶40∶20;洗脱程序:T(min)/B(%):0/0;2.1/0;19.2/57;19.8/100;21.3/100;24.2/0;26/0;检测波长:338 nm(OPA);262 nm(FMOC);柱温:40℃;流速:2 mL/min。

1.4 荔枝酒酿造的工艺流程

荔枝→榨汁→加酶酶解→调整成分→灭酶→澄清→发酵→发酵结束→下胶澄清→过滤→贮藏→装瓶方案一:发酵温度12℃;方案二:发酵温度15℃

2 结果与分析

2.1 荔枝酒中氨基酸测定方法分析

准确吸取1 nmoL/μL的氨基酸混标1 μL，衍生剂(OPA、FMOC)以及硼酸盐缓冲溶液，设置程序进样，进行柱前衍生，氨基酸标品的液相色谱图见图1。

图1 氨基酸标品的液相色谱图

选取5个不同浓度梯度的氨基酸标准溶液(1、3、5、7、9 nmol)，按色谱条件分别进行测定，各水平重复测定6次，以峰面积y对浓度x(mg/L)进行线性回归计算，结果见表1。

表1 氨基酸标准曲线的回归方程

表1结果显示，线性试验中氨基酸各组分浓度与各峰面积呈良好线性关系，除了亮氨酸外，其余15种氨基酸标准曲线的相关系数R2值均大于0.99。精密度RSD%均低于2%，说明该方法精确、稳定，可以满足氨基酸的定量分析。以荔枝酒样品为基底进行加标回收率试验，在样品中加入已知含量的氨基酸混标，按测定方法要求进行回收试验，分析样品回收率。结果表明，荔枝酒样品氨基酸加标回收率均在82.88%～104.82%。说明该分析方法准确、可信并具有较高的灵敏度。

2.2 不同发酵方式对氨基酸含量的影响

2.2.1 不同酿造工艺对荔枝原酒中氨基酸含量的影响

表2 不同酿造工艺的荔枝原酒中的氨基酸含量 mg/L

表2表明，不同酿造工艺的荔枝原酒中氨基酸的种类大致相同，含量有所差异。发酵方案一:荔枝酒中总的氨基酸含量较高，达到847.676 mg/L;发酵方案二:氨基酸总量为720.798 mg/L，其中丙氨酸的含量最高，为412.261 mg/L和352.049 mg/L，分别占总氨基酸含量的48.6%和48.8%。荔枝酒中游离氨基酸主要为L-丙氨酸。L-丙氨酸具有特殊的甜味，能够有效地改善有机酸的酸味，使荔枝酒风味更加和谐，其含量高低对荔枝酒口感及风味有直接影响[4］。

2.2.2 不同贮藏方式对氨基酸含量的影响

表3显示，不同贮藏方式对荔枝酒中氨基酸含量和种类影响不同。其中，Asp、Thr、Lle在原酒中未检查到含量，但在贮藏后检测到了含量;Met在原酒中检测到了含量，但在不同的贮藏条件下，未检测到含量;His在原酒中含量为144.021 mg/L，经常温瓶储、冰箱瓶储和罐储，含量减少到2.427、1.714、1.221 mg/L。其中，天冬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸呈甜味，组氨酸呈苦味，在荔枝酒贮藏过程中，甜味物质增加，而苦味物质含量降低。表明经过酒精发酵后的苹果酸乳酸发酵以及荔枝酒的后熟过程，相当数量的氨基酸被释放到了酒中，能够使荔枝酒中的不良风味物质减少，使其风味口感增加。

表3 不同贮藏方式的荔枝酒中的氨基酸含量 mg/L

2.3 荔枝酒发酵过程中氨基酸的动态变化

根据氨基酸含量的变化趋势，将荔枝酒中氨基酸分为3组:1.天冬氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、异亮氨酸;2.丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸;三、组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸。以3组氨基酸含量的变化趋势，研究不同发酵方案对氨基酸变化的影响。

2.3.1 天冬氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、异亮氨酸的变化

图2显示，不同的发酵方案对荔枝酒中甲硫氨酸、丝氨酸和异亮氨酸含量变化趋势的影响相似，甲硫氨酸、丝氨酸和异亮氨酸的含量先减后增再减，最后趋于平缓，变化规律基本一致。天冬氨酸的含量变化略有不同，其含量先增再减，最后趋于平缓。表明不同的氨基酸在酿造过程中含量的变化也不同。在荔枝酒的酒精发酵过程中，酿酒酵母可以利用氨基酸合成结构性和功能性蛋白质，用来生长酵母菌体及合成酶类，也可以作为氮源使用，氨基酸被酵母细胞分解，分子中的氮常以氨的形式释放出来用作合成细胞含氮组织[5］。所以发酵后酒体中的氨基酸总量会大量减少。天冬氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸作为酵母主要的营养氮源被酿酒酵母快速利用，且在发酵后期没有生成，因此，四种氨基酸在发酵后期含量较低，几乎完全被消耗且趋于平缓。

图2 荔枝酒酿造过程中天冬氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和异亮氨酸氨基酸的变化

2.3.2 丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸的变化

图3表明，不同的发酵方案对荔枝酒中丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸含量的影响不同。其中，不同发酵方案在发酵前对氨基酸含量的影响不明显，发酵结束后，丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸含量的降低，并趋于平缓;发酵方案二中，酪氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸在发酵结束后变化较大。表明不同的氨基酸在酿造过程中含量变化不同，酿酒酵母在酒精发酵过程中利用了这些氨基酸，但利用程度没有图2中天冬氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、异亮氨酸彻底。由于发酵前果汁中天门冬氨酸、异量氨酸的含量比较高，足够供酵母生长发酵所需，同时其他氮源会转化生成谷氨酸，导致谷氨酸发酵后含量相对较高。发酵结束后及储藏过程中，丙氨酸含量最高，其次是谷氨酸;苯丙氨酸和亮氨酸含量较低，其中丙氨酸呈甜味，谷氨酸呈鲜味，苯丙氨酸和亮氨酸均呈苦味。缬氨酸在发酵方案二中变化趋势不稳定，可能是当酒醪中的α-氨基酸缺乏或比例不合理时，诱导酵母自身合成一些缬氨酸，产生大量的双乙酰等物质，此过程会破坏酒的品质，使其风味欠缺[6-8］。

图3 荔枝酒酿造过程中丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸的变化

2.3.3 组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的变化

从图4可以看出，荔枝汁中组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的含量很少，甚至为零，表明这几种氨基酸基本不被酿酒酵母所利用。组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸在酿造过程中含量变化较大，组氨酸在发酵前，含量趋于零，发酵后，其含量在后续步骤中变化不规律，且不同的发酵方案对组氨酸含量的影响不同，方案一中组氨酸在澄清过滤后含量接近零，组氨酸呈苦味，澄清过滤后分解消失，从而减少了荔枝酒中苦味物质。荔枝汁中不含半胱氨酸，荔枝酒含有少量的半胱氨酸，半胱氨酸在发酵方案一中，在发酵时检测了含量(1.67 mg/L)，其后半胱氨酸消失;发酵方案二在发酵时检测到微弱的半胱氨酸，在储藏4个月时再次检测到含量(2.92 mg/L)，其他过程未检测到半胱氨酸。可能是由于此时荔枝酒中氨基酸被利用，氮素营养贫乏，会有利于含硫的氨基酸合成半光氨酸。甘氨酸在发酵方案一时，未检测到含量，方案二发酵后，在储藏4个月时检测到甘氨酸(109.3 mg/L)，此时苏氨酸含量大量减少，会直接代谢生成甘氨酸，导致甘氨酸含量增多。其他处理未检测到甘氨酸。精氨酸在发酵方案一时，未检测到含量，方案二发酵后，在储藏1个月时检测到精氨酸，且含量较高(790.3 mg/L)，其后含量变为零，精氨酸具有苦味和霉味，在荔枝汁及荔枝酒中含量较少，从而增加了酒的感官品质。表明荔枝酒中组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的含量不仅受发酵方案即发酵温度的影响，也受其他处理的影响，且发酵方案二中氨基酸在储藏过程中不稳定[9-10］。

图4 荔枝酒酿造过程中组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的变化

3 结论与讨论

通过HPLC分析荔枝汁和荔枝酒中16种游离氨基酸的含量，并对荔枝酒酿造过程中氨基酸变化趋势进行了研究，可以得出以下结论:

(1)对荔枝酒中氨基酸的测定方法进行了分析，结果表明:16种氨基酸的浓度与各峰面积呈良好线性关系，由样品精密度及荔枝酒氨基酸加标回收率试验来确定该方法的灵敏度、准确性，测定的RSD值均低于2.0%。加标回收率均在82.88%～104.82%，说明该分析方法准确、可信并具有较高的灵敏度。

(2)荔枝汁和荔枝酒中均含有丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸、丝氨酸等14种氨基酸，其中富含8种必需氨基酸。L-丙氨酸是荔枝汁中和荔枝酒的主体氨基酸，含量分别达1139.682、341.049～412.161 mg/L。不同发酵方式酿造的荔枝酒，其游离氨基酸的种类大致相同，但其含量有所差异，即发酵温度影响荔枝酒中游离氨基酸含量。且不同贮藏方式的荔枝酒中氨基酸含量和种类影响也不同。

(3)在荔枝酒酿造的动态过程中，荔枝酒中游离氨基酸种类和含量变化较大。其中，甲硫氨酸、丝氨酸和异亮氨酸含量变化趋势的影响相似，且作为酵母主要的营养氮源被酿酒酵母快速利用，几乎被完全消耗。丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸在发酵过程中被酵母部分利用，发酵结束后及储藏过程中，丙氨酸含量最高，其次是谷氨酸，苯丙氨酸和亮氨酸含量较低;丙氨酸具有特殊的甜味，能够有效地改善有机酸的酸味，使荔枝酒风味更加和谐，其含量高低对荔枝酒口感及风味有直接影响，谷氨酸呈鲜味，苯丙氨酸和亮氨酸均呈苦味。缬氨酸可产生双乙酰等物质，对风味有较大影响。

荔枝汁中组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸的含量很少，甚至为零，表明这几种氨基酸基本不被酿酒酵母所利用，且在酿造过程中含量变化较大，甚至又生成此氨基酸。

(4)发酵温度对氨基酸含量影响颇大，从而影响其风味及口感，整体上看，发酵方案二(15℃)中氨基酸含量在贮藏过程中变化幅度较大，不稳定，且生成苦味和涩味的氨基酸较多。因此，从荔枝酒中氨基酸含量以及其风味这一方面考虑，故发酵方案一(12℃)优于发酵方案二(15℃)，即荔枝酒适宜低温发酵。

本试验通过检测工厂中两种发酵方式的荔枝酒中氨基酸的种类和含量，以及发酵过程及贮藏过程中氨基酸的变化，以期初步探讨氨基酸在发酵过程中的代谢原理，但文章并未对其他工艺参数对荔枝酒风味物质的影响进行研究，也未对风味物质代谢过程进行代谢监控，弄清荔枝酒发酵过程中氨基酸变化与多种酶学反应的相关性，后期实验可深入研究发酵过程中氨基酸的代谢机理，以及合成氨基酸的关键酶类，并对关键酶类进行深入的分析，弄清氨基酸的合成途径。

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ABSTRACTThe variation of amino acids during the brewing process of litchi wine at different fermentation temperature were studied by high performance liquid chromatography(HPLC).The results showed that the lychee juice and litchi wine both contained 14 kinds of amino acids，such as alanine，threonine，valine，glutamic acid，serine，and so on.Among them，L-alanine was the main amino acid and its content reached 1139.682 mg/L and 341.049～412.161 mg/L in lychee juice and litchi wine respectively.During the dynamic brewing process of litchi wine at different temparature，the contents and types of free amino acids were varied with different trend.Different storage way had different impact on types and content of amino acid.Fermentation temperature influenced free amino acid content of litchi wine，and 12℃ was better than 15℃.The amino acids contents of litchi wine fermentated at 15℃changed obviously and unsteadily，and contained more amino acids that influenced the flavor.

Key wordslitchi wine，amino acid，HPLC，fermentation，dynamic variation

Study on Variation of Amino Acid During Brewing Process of Litchi Wine

Shen Ying1，Liu Xiao-yan1，2，Bai Wei-dong1，2，Zhao Wen-hong1，2，Qian Min1
1(College of Light Industry and Food Science，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China)
2(College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

硕士研究生(白卫东教授为通讯作者，E-mail:whitebai2002@ybhoo.com.cn)。

*广州市科技局科技项目(2010Z1-E021);广东省教育部产学研项目(2011B090400065);国家星火计划项目(2010GA781001，2011GA780013)

2011-12-13，改回日期:2012-03-20