花生中辅酶Q10的提取工艺及含量测定*

王改玲，宋瑞雯，陶志杰，孙晓侠

1(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠，233030)

2(辽宁师范大学生命科学院，辽宁大连，116081)

花生中辅酶Q10的提取工艺及含量测定*

王改玲1，宋瑞雯2，陶志杰1，孙晓侠1

1(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠，233030)

2(辽宁师范大学生命科学院，辽宁大连，116081)

花生中富含辅酶Q10，以高效液相色谱法测量的辅酶Q10含量为指标，系统研究了利用超声波细胞破碎仪从花生中提取辅酶Q10时不同提取条件对其含量的影响。结果表明:4个因素对提取率影响大小的顺序为:提取功率＞提取时间＞单次辐射时间＞料液比，其中提取功率和提取时间对花生中辅酶Q10的提取率有极显著影响。最佳工艺参数为:提取功率400 W，提取时间15 min，单次辐射时间为6.0 s/5.0，料液比为1∶6，在此条件下花生中辅酶 Q10的提取率为92.4 μg/g。

花生，辅酶Q10，高效液相色谱法

辅酶Q10是一种脂溶性的类维生素物质，广泛存在于动物、植物、微生物等细胞的线粒体上，主要结合在线粒体内膜上，构成呼吸链中的重要递氢体。具有清除自由基、维持细胞膜的通透性和提高机体自身免疫力的功能，对心脏、肝脏和肾脏有较好的保健作用，在临床上广泛用于心血管疾病、肝病、中风和癌症的治疗[1-2］。此外，由于辅酶Q10所具有的独特生理活性在食品添加剂、化妆品等行业也具有广阔的应用前景。资料显示，目前全球辅酶Q10的年消费量高达500多吨，而我国年需求量约为60多吨。目前辅酶Q10的制备方法主要有生物组织提取法、微生物发酵法和化学合成法3种[3-5］。对辅酶Q10的生物组织提取主要集中在烟草等植物，而研究表明花生中也含有大量的辅酶Q10[6］，而关于花生中辅酶Q10报道很少，本课题组主要研究如何利用当地的大量花生资源，从中制备辅酶Q10，旨为花生中辅酶Q10的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

花生，购自安徽蚌埠。

三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、无水乙醇等试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);辅酶Q10标准品(阿拉丁试剂，分析标准品≥98%);HPLC所用流动相为色谱级甲醇。

高效液相色谱仪(Waters 2487紫外检测器，Wa-ters 1575二元泵);UH-500B型超声波细胞粉碎仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司;RE52CS型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;BS224S型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;FW-100型高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取辅酶Q10标准品10 mg于25 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇适量振摇溶解并稀释至刻度。制成400 μg/mL的标准储备液。准确量取储备液0.1、1、2、4、6 mL分别置于10 mL容量瓶中并用无水乙醇定容至刻度，制成系列标准溶液待测。

1.2.2 辅酶 Q10含量测定

采用HPLC法测定辅酶Q10含量，色谱条件为:以V(甲醇)∶V(乙醇)=30∶70为流动相，色谱柱温度:35℃;流速:1 mL/min;样品进样体积 20 μL;检测波长:275 nm。记录辅酶Q10峰面积，利用回归方程求的其含量。

1.2.3 辅酶 Q10提取方法[7］

称取干燥粉碎好的样品5 g置于50 mL离心管中，加入30 mL甲醇，浸提5min，离心(3000 r/min，10 min)去上清液。固形物中加30 mL溶剂，不同条件下利用超声波破碎仪提取。提取液离心得上清液，重复一次，合并上清液。将上清液减压浓缩至半干，浸膏中加5 mL流动相，在超声波清洗仪中溶解3 min，溶液用0.45 μm滤膜过滤，收集滤液待测。

1.2.4 单因素试验

以提取量为测定指标，进行单因素试验以确定提取溶剂、超声波输出功率、超声波单次辐射时间、提取总时间、料液比5个因素对辅酶Q10提取量的影响。

1.2.5 正交试验

在单因素试验的基础上，进行4因素3水平正交试验，采用L9(34)正交实验设计方案进行优化提取实验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 线性范围和精密度试验

取标准系列溶液进行HPLC进样分析，进样量10 μl，以峰面积对浓度进行线性回归，得到回归方程Y=11798X+1370.4。R2=0.9992(n=5)表明辅酶Q10在4～240 μg/mL内积分面积和浓度线性关系良好。取浓度80 μg/mL的标准溶液连续进样5次，其峰面积RSD=0.5%。

2.2 单因素试验

2.2.1 不同提取溶剂对辅酶Q10提取量的影响

在其他超声波提取条件固定的情况下，利用不同的溶剂提取发现。如图1所示，不同提取溶剂提取效果差异较大。乙醇溶液的提取率最低仅为33 μg/g，三氯甲烷和乙酸乙酯的提取率较高，可以达到81 μg/g，且两者相差不大。考虑到三氯甲烷对人体危害性大于乙酸乙酯，故选用乙酸乙酯作为提取溶剂。同时发现，如果在用超声波细胞破碎仪提取前用甲醇处理，4种溶剂的提取率都有所提高，其中乙酸乙酯提高了8﹪。而且得到的色谱图较没用甲醇处理的杂质数量要少些，峰型也要好一些。主要可能因为用甲醇短时间处理可以去点一些脂溶性杂质，同时也使溶剂的的细胞组织穿透力增强，有利于目标成分的提取。

2.2.2 超声波提取时间对辅酶Q10提取量的影响

如图2所示，在其他提取条件相同的情况下，随着提取时间的延长，辅酶Q10的提取率有明显增高的趋势，提取5min时辅酶Q10含量仅为37 μg/g，当提取时间为10 min时，辅酶Q10含量增高了48%。15 min后，辅酶Q10含量达到最高88 μg/g。然而其含量并没有随着时间的延长一直增高。提取20 min时含量较15 min时不但没有增加，反而呈下降趋势，这可能是因为随着提取时间的延长，大量辅酶Q10被提取到溶剂中，但是同时由于受氧气和光照的影响辅酶Q10也在不断地降解而导致的。同时考虑到提取时间越长杂质含量也越多，为后面的纯化分离增加困难，因此，选用提取时间15 min为最佳提取时间。

图1 不同提取溶剂对辅酶Q10提取量的影响

图2 超声波提取时间对辅酶Q10提取量的影响

2.2.3 超声波提取功率对辅酶Q10提取量的影响

从图3可以看到，辅酶Q10提取量随着超声波提取功率的增加呈先升后降的趋势。提取功率小于200 W时辅酶Q10含量较低，考虑主要可能是因为功率过小，花生组织不能被完全破坏，使得辅酶Q10不能完全溶解到溶剂中，增加功率有利于溶剂中空穴效应的形成，从而产生大量空化泡，使得破碎作用加强，大量辅酶Q10被释放到溶剂中，故提取功率从100 W升到400 W时辅酶Q10含量随提取功率的增加而增加。然而提取功率＞400 W时辅酶Q10含量却又呈下降趋势，主要可能是由于超声波处理引起的局部高温高压使溶液中H和OH自由基含量增加而导致辅酶Q10氧化降解[8］。故选择超声波提取功率400 W为花生中辅酶Q10的最佳提取功率。

2.2.4 超声波单次辐射时间对辅酶Q10提取量的影响

图3 超声波提取功率对辅酶Q10提取量的影响

在超声波提取功率为400 W，提取时间15 min，料液比例为1∶5的条件下，由图4可知，超声波单次辐射时间在6.0～8.0 s，间歇时间5 s时提取效果较好。超声波破碎细胞的过程也就是空化泡形成、震动、膨胀、压缩和崩溃闭合的过程[9，10］。当单次辐射时间低时，辅酶Q10提取量较少，这是由于辐射时间过短，超声波空化效应不能发挥爆裂破壁作用导致的。但是当单次工作时间超过8.0 s后，虽然能产生大量空化泡而是细胞破裂，但同时会产生较多活性氧而引起辅酶Q10含量下降。因此，最佳的单次超声时间/间歇时间为 6.0 s/5.0 s～8.5 s/5.0 s。

图4 超声波单次辐射时间对辅酶Q10提取量的影响

2.2.5 料液比对辅酶Q10提取量的影响

由图5可以看出，提取溶剂量为20 mL时，辅酶Q10提取量较小，这一方面是因为溶液中花生组织浓度大，不利于空化泡的形成;另一方面是因为提取溶液少时，溶液中的辅酶Q10浓度较大，在离心过滤时大量辅酶Q10黏附在花生残渣上损失而导致含量减少。当料液比大于1∶5时，增加料液比对辅酶Q10提取量的影响幅度不是很大。料液比从1∶4增加到1∶5，辅酶Q10提取量提高了32%，而料液比从1∶5增加到1∶8，辅酶Q10提取量仅仅提高了26%。这主要是因为利用超声波细胞破碎仪提取不同于传统的浸提法，提取量受细胞内外浓度差的影响较小。料液比大于1∶8后，提取量下降可能是由于溶剂量加大后，超声波在溶剂中传递的损失增大，细胞破碎效果变差导致的。故料液比为1∶7为花生中辅酶Q10的最佳溶剂用量。

2.3 正交试验

图5 料液比对辅酶Q10提取量的影响

超声波破碎法提取花生中辅酶Q10的正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析结果

从表2和表3可以看出超声波功率和提取时间对辅酶Q10提取量有极显著影响，超声波单次辐射时间影响显著，而料液比对辅酶Q10提取量的影响较小。4个因素对提取率影响大小的顺序为:提取功率＞提取时间＞单次辐射时间＞料液比。综合各因子的k值比较可得到A2B2C3D3为最佳提取条件，即提取时间15 min，输出功率400 W，单次辐射时间10.0 s/5.0 s，溶剂用量为 40 mL，即料液比为 1∶8。取 5份花生材料在此条件下做验证试验得辅酶Q10平均提取量为 92.4 μg/g，RSD=1.18%

2.4 超声波破碎仪提取与传统提取方法比较

取5 g花生材料3份，分别采用浸提法、超声波破碎仪提取和碱醇皂化法提取[4-5］，结果显示超声波法辅助提取效果更佳，辅酶Q10提取量为91.9 μg/mL，碘醇皂化法辅酶Q10提取量为56.3 μg/mL，普通浸提法提取量最低仅有30 μg/mL。所以用超声波破碎仪提取辅酶Q10操作简便，省时，提取效率高。

3 结论

本研究优化了超声波破碎仪提取辅酶Q10的提取工艺，确定最佳提取工艺为提取时间15 min，输出功率400 W，单次辐射时间10.0 s/5.0 s，溶剂用量为40 mL，即料液比为1∶8。在该条件下辅酶Q10平均提取量高达92.4 μg/g。和其他传统方法相比，提取率高，省时省力，且操作方便。对于花生中的辅酶Q10的工业化提取具有良好的应用前景。后续的研究工作主要集中在如何分离富集花生中的辅酶Q10。

[1]桑艳双，魏敏吉.辅酶Q10的生化作用机理和药物临床应用进展[J］.中国医药导刊，2005，7(5):371-373.

[2]张楠，曹玉成.辅酶Q10制备方法研究进展[J］.榆林学院学报，2006，16(6):12-14.

[3]王青云，王发祥.微生物发酵法生产辅酶Q10的研究进展[J］.化学与生物工程，2006，23(8):11-13.

[4]吕茂春，李英华，安艳秋，等.辅酶Q10几种提取工艺的优化研究[J］.食品科学，2007，28(12):132-135.

[5]龙海燕，郭育涛，邢远清.超声辅助皂化提取黑曲霉中辅酶Q10的研究[J］.应用化工，2007，36(3):265-269.

[6]张姣勤，陈军，李子雨，等.花生功能活性成分研究进展[J］.粮油加工，2008，12:73-76.

[7]王辛，乔海鸥，穆敏杰.保健食品中辅酶Q10含量的测定及其提取条件的研究[J］.中国卫生检验杂志，2008，18(7):1321-1323

[8]李聚海，岳田利，袁亚宏.辅酶Q10超声波破碎法提取工艺条件研究[J］.西北农林科技大学学报，2007，35(5):207-211.

[9]欧阳琴，陈兴才，黄亚治.雨生红球藻提取虾青素不同机械破壁方法的研究[J］.福州大学学报:自然科学版，2005，33(1):111-115.

[10]许晖，孙兰萍，李善菊.等.超声波辅助提取亚麻籽油的工艺条件优化[J］.中国粮油学报，2009，24(7):64-68.

ABSTRACTPeanut contains coenzyme Q10，the content of Q10was detected by HPLC.The effect of different conditions by using ultrasonic cell-break method for extraction was systematically studied.The results showed that the size order of influence by four factors on the extraction rate was:extraction power＞extraction time＞duration of radiation each time＞ratio of material to liquid.The power extraction and extraction time had significant effect on the extraction rate of coenzyme Q10.The optimal condition for coenzyme Q10extraction was as follows:400W，extraction time:15min，duration of radiation:6.0s/5，ratio of solid to liquid:1∶6.Under this condition，the coenzyme Q10extraction rate was 92.4ug/g.

Key wordspeanut，coenzyme Q10，HPLC

Extraction Technology and Content Determination of Coenzyme Q10in Peanut

Wang Gai-ling1，Song Rui-wen，Tao Zhi-jie1，Sun Xiao-xia1
1(Department of Biology and Food Engineering，Bengbu College.Anhui，Bengbu 233030，China)
2(Life Science College，Liaoning Normal University，liaoning，Dalian 116081，China)

硕士研究生，讲师(陶志杰为通讯作者)。

*蚌埠学院院级科研项目(2010ZR17)

2012-04-02，改回日期:2012-04-26