超声波提取缢蛏多糖及脱蛋白工艺

许静

（哈尔滨工业大学（威海）海洋学院，山东威海264209）

超声波提取缢蛏多糖及脱蛋白工艺

许静

（哈尔滨工业大学（威海）海洋学院，山东威海264209）

采用超声波法对缢蛏多糖进行了提取，正交试验确定了最佳提取工艺条件：超声功率440 W，提取时间60 min，提取温度80℃，料液比1∶30（g/mL）。在此条件下，缢蛏粗多糖提取率为8.31%。对比了Sevag法和三氯乙酸法对缢蛏粗多糖脱蛋白的影响，实验结果表明三氯乙酸法在蛋白质脱除率和多糖损失率两个方面的综合指标较理想，三氯乙酸法处理3次后，蛋白质脱除率达到69.75%，缢蛏多糖损失率为26.68%。

缢蛏；多糖；提取；脱蛋白

Abstract:In this paper the polysaccharide was extracted from the Sinonov acula constricta by ultrasoundassisted method.The optimum conditions obtained by the orthogonal test as follow：ultrasonic power 440 W,ultrasonic extraction time 60 min,extraction temperature 80 ℃ and material to water ratio 1∶30(g/mL).With these conditions,the highest extracting amount of polysaccharide reached to 8.31%.The effect of deproteinization was evaluated through the comparation of the Sevaq method and the trichloroacetic acid （TCA）method.The experimental results indicate that the TCA method has the higher deproteinization rate and lower polysaccharides loss rate.For 3 times of deproteinization by TCA method，the results were：the deproteinization rate 69.75%and the polysaccharides loss rate 26.68%.

Key words：Sinonov acula constricta；polysaccharide；extraction；deproteinization

多糖是构成生命的重要基本物质之一，具有促进机体免疫力、抗肿瘤、抗放射性、抗衰老等多种活性[1-2]。随着对多糖研究的深入，海洋生物多糖越来越引起人们的关注。徐红丽等从贻贝中分离出一种具有抗肿瘤活性的多糖[3]，王长云等从海湾扇贝边中提取分离出一种具有显著抗凝血活性的氨基多糖[4]。研究表明贝类多糖是贝类体内一种含量丰富的生物活性物质[5]，具有较高的开发价值。

缢蛏（Sinonov acula constricta），俗称蛏子，属软体动物，系瓣鳃纲，真瓣鳃且、竹蛏科，广泛分布于我国沿海地区，是一种大众化的海产食品。中医认为，缢蛏肉具有有清热解毒、补阴除烦、益肾利水[6]等作用。目前，缢蛏主要用于食用，对其所含生物活性物质的研究鲜有报道，本文对缢蛏肉多糖的提取及脱蛋白工艺进行了系统研究，为缢蛏的综合开发利用提供基础的研究资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

缢蛏：购于威海水产市场；硫酸、苯酚、乙醇、丙酮、正丁醇、三氯甲烷等所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DS-1电动组织捣碎机：上海精科实业有限公司；TDL-60离心机：上海安亭科学仪器厂；JY92-II型超声波细胞粉碎机：上海比朗仪器有限公司；FD-1D冷冻真空干燥机：上海精密仪器仪表有限公司；UV-2000紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州华普达教学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 缢蛏多糖的提取

新鲜缢蛏去壳后用水进行清洗沥干，组织绞碎机打碎，浸泡于丙酮中4℃过夜脱脂，沥干备用。称取一定量缢蛏粉碎组织，置于超声波细胞粉碎机中浸提，以超声时间、超声功率、提取温度、料液比为可变因素，在不同条件下进行超声提取[7]。提取液离心取上清减压抽滤，加入3倍体积的95%乙醇，减压抽滤、真空冷冻干燥即得缢蛏多糖。

1.3.2 多糖含量的测定

采用苯酚－硫酸比色法测定多糖的含量[8]。准确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品20 mg，定容至500 mL。各吸取标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分别加入试管，并以水补至1.0 mL，加入5%的苯酚1mL，再加入浓硫酸5 mL，混匀后，沸水浴加热30 min，冷却后于490 nm处测定吸光度（OD）。横坐标为吸光度值，纵坐标为葡萄糖浓度，得到回归方程Y=0.654X-0.0076，R2=0.9986。取1.0 mL多糖样品溶液,依标准曲线的方法测定其多糖含量。

1.3.3 缢蛏多糖的脱蛋白

以蛋白脱除率、缢蛏多糖损失率为评价指标，对比Sevag法、三氯乙酸法对粗多糖脱蛋白的影响[9]。采用考马斯亮蓝法检测粗多糖中蛋白含量，苯酚-硫酸法检测多糖含量。Sevag法脱蛋白：取100 mL浓度为10.0 mg/mL缢蛏多糖水溶液，加1/3体积的Sevag试剂，搅拌30 min，静置分离，收集上层缢蛏多糖水溶液，取样测量并计算其蛋白质和多糖含量，反复处理8次；三氯乙酸法脱蛋白：取100 mL浓度为10.0 mg/mL缢蛏多糖水溶液6份，加入20%三氯乙酸溶液至溶液终浓度为 5%，搅拌 30 min，4℃静置 12 h，4000 r/min离心5 min，收集上层缢蛏多糖水溶液，取样测量并计算其蛋白质和多糖含量，反复处理6次。

2 结果与分析

2.1 缢蛏多糖提取单因素试验

2.1.1 超声功率对多糖提取量的影响

在料液比为 1∶30（g/mL）、温度为 50 ℃、提取时间60 min的条件下提取，研究不同的超声功率200、280、360、440、520、600 W对缢蛏多糖提取效果的影响，计算提取率，比较不同超声功率多糖的提取率见图1。

如图1可知，多糖的提取率随着超声波功率的升高而增加，当功率达到440 W时，缢蛏多糖提取率达到最大值，继续增大功率，多糖提取率有所降低。这可能是因为超声波的“空化效应”产生的细胞破壁作用提高了多糖的浸出率，从而使多糖的得率提高。当超声波功率过高时可能破坏了多糖分子的结构，使多糖降解，反而使多糖得率降低，因此初步确定最佳超声功率为440 W。

2.1.2 对多糖提取量的影响

在料液比为 1∶30（g/mL）、温度为 50 ℃、超声功率440 W的条件下提取，研究不同的超声时间20、40、60、80、100、120 min对缢蛏多糖提取效果的影响，计算提取率，比较不同超声时间多糖的提取率见图2。

如图2所示，酶解时间由20 min增加到60 min，多糖提取率显著提高。超过60 min后，多糖的提取率反而有所下降。这可能是超声长时间的作用对多糖结构产生了破坏，导致多糖降解，因此初步确定超声提取最佳时间为60 min。

2.1.3 对多糖提取量的影响

在料液比为 1∶30（g/mL）、超声时间 60 min、超声功率440 W的条件下提取，研究不同的提取温度30、40、50、60、70、80℃对缢蛏多糖提取效果的影响，计算提取率，比较不同超声时间多糖的提取率见图3。

如图3所示，多糖的提取量随温度的升高而显著增加，说明在30℃～80℃范围内，温度越高对细胞壁的破坏作用越强，越有利于胞内物质的浸出，因此初步确定最佳提取温度应在80℃左右。

2.1.4 料液比对多糖提取量的影响

在超声时间60 min、超声功率440 W、提取温度80 ℃的条件下提取，研究不同的料液比 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）对缢蛏多糖提取效果的影响，计算提取率，比较不同超声时间多糖的提取率见图4。

由图 4 所示，料液在比 1∶20～1∶30（g/mL）时，多糖的提取量随着液料比的增加明显提高，料液比大于1∶30（g/mL）时，多糖的提取率增加缓慢。考虑液体过多导致浓缩时浪费能源，综合考虑最佳料液比为1∶30（g/mL）。

2.2 多糖提取工艺的优化

根据单因素试验结果，以超声时间、超声功率、提取温度、料液比4个因素进行L9（34）正交试验，以获取最佳试验条件。试验结果见表1。

表1 多糖提取正交试验结果Table 1 Polysaccharide extracting rate of orthogonal test

正交试验结果如表1所示，各因素的影响次序为：提取温度＞提取时间＞料液比＞超声功率。由表中可以看出，最佳组合因素为A2B2C3D1，即超声功率为440 W，提取时间为60 min，提取温度为80℃，料液比为1∶30（g/mL），试验结果多糖得率为8.31%。因此,确定缢蛏多糖提取的最佳工艺条件为A2B2C3D1。

2.3 Sevag法与三氯乙酸法脱蛋白效果

2.3.1 Sevag法脱蛋白的效果

Sevag法脱蛋白对蛋白质脱除率、多糖损失率的影响见图5。

由图5可以看出，随着Sevag法脱蛋白次数的增加，缢蛏多糖溶液中蛋白质脱除率逐渐增加，而多糖损失率也在逐渐增加，处理5次后，蛋白质脱除率增加的幅度放缓。处理5次后蛋白质脱除率达到62.76%，而多糖损失率为34.35%。Sevag法脱蛋白需重复多次，效率较低，并且缢蛏多糖的损失量较大，同时有机溶剂的大量使用也会对环境造成污染，综合考虑以上因素，Sevag法不适合缢蛏多糖的脱蛋白处理。

2.3.2 三氯乙酸法脱蛋白的效果

三氯乙酸法脱蛋白对蛋白质脱除率、多糖损失率的影响见图6。

由图6可以看出，三氯乙酸法脱蛋白处理3次后，蛋白脱除率为69.75%，多糖损失率为26.68%，较Sevag法相比，三氯乙酸法操作次数少，蛋白脱除率效率高，多糖损失率较低，效果优于Sevag法。

3 结论

缢蛏多糖的提取最佳工艺条件为：超声功率440W，提取时间 60 min，提取温度 80 ℃，料液比 1∶30（g/mL），缢蛏粗多糖得率为8.31%。

采用Sevag法和三氯乙酸法对缢蛏粗多糖脱蛋白，结果表明：Sevag法需重复多次，效率低；三氯乙酸法在蛋白质脱除率、多糖损失率两个方面的综合指标较理想，三氯乙酸法处理3次后，蛋白质脱除率达到69.75%，缢蛏多糖损失率为26.68%。

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Study on the Extraction Technology with Ultrasound-assisted and Deproteinization Technology of Polysaccharide from Sinonov Acula Constricta

XU Jing
（College of Marine Science,Harbin Institute of Technology at Wei Hai,Weihai 264209，Shandong,China）

2011-12-29

许静（1973—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品生物技术。