白骨壤种子中总黄酮的提取及抗氧化性研究

熊拯，钟秋平，林美芳，唐媛园

（钦州学院海洋学院，广西 钦州 535000）

白骨壤种子中总黄酮的提取及抗氧化性研究

熊拯，钟秋平，林美芳，唐媛园

（钦州学院海洋学院，广西 钦州 535000）

采用乙醇恒温水浴法对白骨壤种子中总黄酮提取和L9（34）正交试验设计进行优化，并采用Schaal烘箱法研究总黄酮的抗氧化性。结果表明，总黄酮最佳提取条件为料液比1:30（g/mL）、提取温度60℃、提取时间4.5 h和乙醇浓度60%，且该条件下总黄酮提取率可达5.89%；白骨壤种子总黄酮对大豆油有一定的抗氧化效果，且具有量效关系；相同添加量下，抗氧化效果由强到弱的顺序为0.02%TBHQ>0.02%BHT>0.02%总黄酮；总添加量为0.06%时，其表现出的抗氧化效果和0.02%TBHQ效果相接近。

白骨壤种子；总黄酮；提取工艺；抗氧化性

白骨壤（Aricennia Marina）是我国红树林中的先锋树种，常见于福建、广东、广西、海南、台湾、香港、澳门沿海，有红树林生长的滩涂[1]。白骨壤种子中黄酮类物质不仅含量高而且种类丰富，在民间长期作为药用，是一种尚未规模开发利用的大然药物新资源，具有较高的研究开发价值；但是目前国内外对白骨壤的开发利用主要集中在脂肪酸、类固醇和多糖等成分[2-3]。

现代医学研究表明，黄酮类物质具有降血糖、降血脂、抗心律失常等40多种生理活性[4-5]。此外，黄酮类物质作为抗氧化剂还广泛应用于食品中[6]。而近年来许多实验表明，由于合成抗氧化剂对人体的危害，如BHA（丁基烃基茵香醚）对白鼠有致癌作用；BHT（二丁基烃基甲苯）可引起动物肝脏增大等作用，现己限制或停止使用。因此，从药食两用植物中筛选出高效低毒目经济的抗氧化性强的天然抗氧化剂成为人们关注的焦点[7]。但目前对白骨壤种子中黄酮类化合物的提取的报道还很少。本实验对白骨壤种子中总黄酮的提取工艺进行研究，旨在为白骨壤的开发利用提供理论基础和实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白骨壤种子：采集于广西防城港市北仑河口；大豆油：大海粮油工业（防城港）有限公司。

95%乙醇，无水乙醇，氢氧化钠，六水合氯化铝，盐酸等试剂均为国产分析纯；芦丁：中国医药（集团）上海化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；XMTA-6000温度调节仪：余姚市亚泰仪器有限公司；101-3型电热鼓风恒温干燥箱：上海东星建材试验设备有限公司；FW-100高速万能粉碎机：上海胜启仪器仪表有限公司；FA2004电子分析天平：上海耀杰仪器有限公司；PHS-3CF型精密酸度计：上海大普仪器有限公司；SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵：上海像华仪器有限公司；UV-160A紫外可见分光光度计：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 白骨壤种子中总黄酮含量测定

参照王作昭和陈丛瑾等的方法[8-9]，总黄酮提取液经过滤后定容至250mL，取定容后滤液1mL置于50mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1.5 mL，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1.5mL，放置6min，加4%氢氧化钠溶液20 mL，加水至刻度，摇匀，静置15 min，在510 nm波长处测其吸光度，按以下公式计算总黄酮含量。

式中：A为提取液定容体积，mL；B为吸取测定体积，mL；C 为线性计算出的浓度，（mg/mL）；D 为测定时定容体积，mL；E为称取的样品质量，g。

1.3.2 白骨壤果实中总黄酮含量测定的标准曲线绘制

参照何文兴等的方法[10]，精密称取标样芦丁20.0mg，用95%乙醇配制成0.1 mg/mL的溶液。分别吸取对溶液 0.0、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，加95%乙醇至3.0 mL，加入1 mL 1%AlCl3-乙醇溶液，95%乙醇乙醇定容，摇匀，放置20 min～30 min，于510 nm处测定其吸光度。以芦丁标准溶液浓度x和吸光度y绘制标准曲线，并采用二元线性回归法求回归方程为y=22.212x+0.0033。结果如图1所示。

图1 总黄酮含量标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.3 各因素对白骨壤种子中总黄酮提取的影响

称取粉碎的干燥样品（过40目筛），加入到具塞锥形瓶中，加入乙醇溶液配成一定的料液比，于恒温水浴浸提，抽滤，合并滤液，蒸发滤液至无醇味，定容至100 mL。取1 mL样液置于10 mL比色管中，加入1 mL 1%AlCl3-乙醇溶液，加95%乙醇至刻度。测定下吸光度，计算黄酮类物质含量。各因素对黄酮类物质提取的影响试验，则在上述试验的基础上改变该因素进行。

1.3.4 白骨壤种子中总黄酮提取工艺的优化

在单因素试验的基础上，以料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、乙醇浓度（D）等4个因素按照L9（34）正交表进行试验。正交因素水平表设计如表1所示。

表1 L9（34）正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test design on extraction condition of total flavonoids

1.3.5 白骨壤种子中总黄酮抗氧化试验[11]

采用Schaal烘箱法，取30 g大豆油，放入100 mL烧杯中，敞口，按一定量加入鼠曲草总黄酮样品或抗氧化剂，混合均匀，将油样放入（60±0.5）℃恒温箱中，强化保存，每隔24小时搅拌1次，并交换它们在恒温箱中的位置，定期测定油样的过氧化值（POV）。按GB/T 5009.37-2003《食用植物油卫生标准的分析方法》定期测定过氧化值。

2 结果与分析

2.1 液料比对白骨壤种子中总黄酮提取的影响

称取6份3.0g样品，加入到6只具塞锥形瓶中，分别加入料液比为 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60（g/mL）的60%乙醇，50℃水浴浸提4 h，抽滤，合并滤液，蒸发滤液至滤液无醇味后与蒸馏水定容至100 mL，总黄酮测定结果如图2所示。

图2 液料比对白骨壤种子中总黄酮提取的影响Fig.2 Effects of ratio of solid to liquid on extraction of total flavonoids

由图2可知，随着料液比的增加，总黄酮的提取率逐渐增加；但当料液比超过1:30以后，总黄酮的提取率基本趋于稳定。在实际操作中既要考虑总黄酮的充分溶出，同时也为避免溶剂的浪费，综合两方面的因素，固液比设置为 1:30（g/mL）时较佳。

2.2 乙醇浓度对白骨壤种子中总黄酮提取的影响

称取7份3.0 g样品，加入具塞锥形瓶中，分别加入料液比为1:30（g/mL），浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，50℃水浴浸提4 h，抽滤，合并滤液，蒸发滤液至滤液无醇味后与蒸馏水定容至100mL，总黄酮测定结果如图3所示。

图3 乙醇浓度对白骨壤种子中总黄酮提取的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction of total flavonoids

由图3可知，随着乙醇浓度的增大，白骨壤种子中总黄酮提的取得率逐渐增加，因为在浓度较低时，乙醇可以促进总黄酮的溶解；但达到乙醇浓度达到60%以后，随着乙醇浓度增大，白骨壤种子中总黄酮提的取得率开始下降，这是因为乙醇浓度过大不利于总黄酮的溶解，所以乙醇浓度以60%左右为宜[11]。

2.3 温度对白骨壤果实中总黄酮提取的影响

称取7份3.0 g样品，加入具塞锥形瓶中，分别加入料液比为1:30（g/mL）、浓度为60%的乙醇，于恒温水浴锅中 30、40、50、60、70、80 ℃下浸提 4 h，抽滤，合并滤液，蒸发滤液至滤液无醇味后与蒸馏水定容至100 mL，总黄酮测定结果如图4所示。

图4 温度对白骨壤种子中总黄酮提取的影响Fig.4 Effects of temperature on extraction of total flavonoids

由图4可知，随着提取温度的增加，总黄酮提取率也逐渐增加，至60℃时提取率最高，其吸光度为3.95；之后随着温度的增加，总黄酮的提取率逐渐下降。可能是因为当提取温度过低时，乙醇的提取没有完全；但温度过高时，乙醇部分蒸发与样品接触不完全[12]。

2.4 时间对白骨壤种子中总黄酮提取的影响

称取7份3.0 g样品，加入到具塞锥形瓶中，分别加入固液比为1:30（g/mL）浓度为60%的乙醇，60℃水浴，分别浸提 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，抽滤，合并滤液，蒸发滤液至滤液无醇味后与蒸馏水定容至100 mL，总黄酮测定结果如图5所示。

图5 时间对白骨壤种子中总黄酮提取的影响Fig.5 Effects of time on extraction of total flavonoids

由图5可知，随着提取时间的增加，黄酮提取率也逐渐增加，在提取时间4.5 h总黄酮提取率达到最高值，其吸光度为3.92 mg/mL；之后随着时间的增加，总黄酮提取率降低。可能是由于提取时间不够时，总黄酮并未完全析出；当时间过长时，部分黄酮反被样品回吸。

2.5 白骨壤种子中总黄酮提取工艺的优化

在上述单因素试验的基础上，以料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、乙醇浓度（D）为主要影响因素，按照L9（34）正交表进行提取优化试验。正交因素水平表和L9（34）正交试验设计表分别如表2和表3所示。

表2 L9（34）正交试验设计和结果Table 2 Results and range analysis orthogonal test

由表2的结果可看出，对提取率影响的大小次序为B（提取温度）＞D（乙醇浓度）＞C（提取时间）＞A（料液比），最佳工艺条件A2B3C3D2。根据最佳工艺条件对白骨壤种子中总黄酮进行提取，测得总黄酮提取率可达 5.89%。

表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

由表3方差分析结果可知，显著水平均大于0.05，即各因素对白骨壤种子中总黄酮提取的影响均无显著性差异。

因此，综合考虑生产周期、耗能等各方面因素，采用乙醇恒温水浴提取白骨壤种子中总黄酮的最佳工艺为料液比 1:30（g/mL）、提取温度 70℃、提取时间 4.5h，乙醇浓度60%，且此条件下总黄酮提取率可达5.89%。

2.6 白骨壤种子中总黄酮抗氧化性研究

本研究选用大豆油样品和不同添加量的白骨壤种子中总黄酮进行抗氧化实验。通过最终过氧化值的差异评价异黄酮的抗氧化性，分析不同添加量与抗氧化性的关系，通过对大豆异黄酮与TBHQ以及BHT的对比实验评价其抗氧化性的强弱，见图6。

图6 总黄酮抗氧化性比较研究Fig.6 Comparative study on total flavonoids antioxidation

由图6可以看出，大豆油中添加总黄酮的抗氧化性比未添加黄酮（空白）的强，且随着总黄酮浓度的增加，抗氧化效果增强；相同浓度下，抗氧化效果由强到弱的顺序为0.02%TBHQ>0.02%BHT>0.02%总黄酮；总黄酮添加浓度为0.06%时，其表现出的抗氧化效果和人工合成抗氧化剂0.02%TBHQ效果相接近。白骨壤种子总黄酮为天然产物，无毒副作用，显示了其良好的应用价值。黄酮类化合物B环上的3',4'-邻二烃基是具有清除自由基生物活性的关键结构，其他位上的烃基起一定作用，这可能是由于邻位烃基的存在可使一个烃基形成碳基之后易与邻位的烃基形成分了内氢键，使氧化后的物质稳定，而中断自由基导致的链反应[14]。

3 结论与讨论

1）采用乙醇恒温水浴提取白骨壤种子中总黄酮的工艺中，4个因素对提取率影响的主次顺序次序为B（提取温度）＞D（乙醇浓度）＞C（提取时间）＞A（料液比）。

2）采用乙醇恒温水浴提取白骨壤种子中总黄酮的最佳工艺为料液比 1:30（g/mL）、提取温度 60 ℃、提取时间4.5 h，乙醇浓度60%，且此条件下总黄酮提取率可达5.89%。

3）大豆油中添加总黄酮的抗氧化性比未添加黄酮（空白）的强，且随着总黄酮浓度的增加，抗氧化效果增强；相同添加量下，抗氧化效果由强到弱的顺序为0.02%TBHQ>0.02%BHT>0.02%总黄酮；添加量为0.06%时，其表现出的抗氧化效果和0.02%TBHQ效果相接近。

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Extraction Technology and Antioxidation of Total Flavonoids from Mangrove Plant Aricennia Marina Seed

XIONG Zheng,ZHONG Qiu-ping,LIN Mei-fang,TANG Yuan-yuan
（School of Ocean,Qinzhou University,Qinzhou 535000,Guangxi,China）

The total flavone were extracted from Avicennia marina seeds by ethanol thermostatic water bath method,the optimal extraction conditions of total flavonoids were determined by orthogonal test L9(34)and some research on antioxidation of total flavonoids were taken by the Schaal oven method.The results showed that:the best total flavone extraction conditions were solid to liquid ratio 1:30(g/mL),extraction temperature 60 ℃,extraction time 4.5 h and ethanol concentration 60%,and under these conditions the extraction rate reached 5.89%;Avicennia marina seed total flavone had certain antioxidation on soybean oil,and it had the same dose-effect relationship;the antioxidation from strong to weak order was 0.02%TBHQ>0.02%BHT>0.02%of total flavonoids;under total dosage of 0.06%,the exhibited antioxidation was close to the 0.02%TBHQ.

Avicennia marina seed;total flavonoids;extraction technology;antioxidation

广西自然科学基金项目（桂科自0991276）；钦州学院科研项目（2008XJKY-13C）

熊拯（1981—），男（汉），讲师，研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。

2012-01-24