动物性食品中磺胺二甲嘧啶快速检测方法

张佳宜

（天津科技大学，天津 300457）

动物性食品中磺胺二甲嘧啶快速检测方法

张佳宜

（天津科技大学，天津 300457）

根据竞争抑制免疫层析原理，应用胶体金免疫层析技术进行磺胺二甲嘧啶在鸡肉和鲫鱼中的残留检测研究。磺胺二甲嘧啶半抗原-OVA和羊抗兔二抗分别作为检测带（T线）和质控带（C线）包被在硝酸纤维素膜上，金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上，制成免疫层析快速检测试纸条。所建立的检测体系对标准溶液的灵敏度达到1 μg/L。成功检测了鸡肉和鲫鱼中的磺胺二甲嘧啶残留。该方法灵敏度高，所用试剂无毒、无污染，无需借助仪器，样品前处理简便，快速，检测过程可在10 min内完成，可以作为现场快速检测动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留的有效手段。

胶体金；免疫层析；磺胺二甲嘧啶；快速检测

磺胺二甲基嘧啶（SMZ）是畜牧养殖业中应用最广泛的磺胺类药物之一，常被添加到饲料中，用于动物疾病的预防和治疗。长期添加或滥用可导致动物性食品中的药物残留，人食用含有SMZ药物残留的食品后，会影响机体的免疫系统，破坏肌肉、肾脏和甲状腺等组织，同时SMZ也有致肿瘤倾向[1]。另一方面容易产生耐药菌株，使药物失去治疗疾病的价值[2]。20世纪90年代以来，SMZ的残留现象非常严重，经常在畜禽和水产品中出现。

目前，检测SMZ残留应用最广泛的是高效液相色谱法[3]。这种方法灵敏度高，但检测时间长，需特殊仪器，投入成本高，不适用于大量样本的现场快速筛选。胶体金免疫层析法（GICA）是20世纪90年代出现的一种快速免疫检测技术，它基于抗原抗体的特异性反应，是将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术[4]。该方法最大特点是简便快速、灵敏准确、成本低廉、不需任何仪器设备，检测结果清楚，易于判断。本论文选取鸡肉和鲫鱼2种检测样品，研究了利用免疫胶体金试纸条快速检测2种样品中SMZ残留的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

ZQ2000切条机、HM3020划膜仪、结合释放垫、PVC背板：上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜、吸收垫、样品垫：Millipore；氯金酸：上海化学试剂有限公司；SMZ 标准品、羊抗兔二抗、BSA：Sigma；SMZ抗体、包被抗原（SMZ-OVA）：天津市食品营养与安全重点实验室制备；鸡肉和鲫鱼为市售，经液相检测为不含磺胺类药物的阴性样品；封闭液：1%BSA-PBS；洗涤液：PBST（含 0.05%Tween-20 的 PBS）；紫外/可见分光光度计：美国CARY 50 Bio，Varian。

1.2 胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法[5]制备40 nm胶体金：1%的柠檬酸三钠水溶液1 mL加入到100 mL 0.01%的HAuCl4水溶液中。

1.3 胶体金标记抗体蛋白

取20 mL胶体金溶液，用0.1 mol/L的K2CO3调节pH到9.0，在磁力搅拌下，逐滴加入0.48 mg纯化后的抗体，10 min后逐滴加入10%的BSA使溶液中BSA终浓度为1%，以稳定胶体金标记物，搅拌30 min后置于4℃过夜。分装到1 mL离心管中，10000 r/min离心30 min，弃上清。用储存液溶解，重复上一步离心，弃上清，用储存液重悬为原体积的1/10，4℃保存备用。

1.4 试纸条的组装

用划膜仪将羊抗兔二抗（0.5 μL/strip）与SMZOVA（0.8 μg/strip）包被在 NC 膜上，作为质控带和检测带；将金标抗体稀释后30 μL/cm喷涂于玻璃纤维上，作为结合释放垫。在PVC背板上依次粘贴吸收垫、硝酸纤维素膜、结合释放垫、样品垫，然后用切条机切成条状（60 mm×4 mm），密封干燥保存。

1.5 方法检出限的测定

将SMZ标准品用含10%甲醇的PBST溶液稀释成一系列梯度，将制备好的试纸条插进上述梯度稀释液中进行竞争反应，5 min后取出，目视辨别颜色深浅，在质控带显色的情况下，检测带颜色越浅，代表SMZ含量越高。以能与空白对照有明显色差的最小浓度为最低检出限。

1.6 样品预处理

鸡肉：称取2 g样品，加4 mL甲醇旋涡振荡提取2 min，过滤，滤液用PBST稀释10倍待测。

鲫鱼：称取2 g样品，加4 mL甲醇旋涡振荡提取2 min，过滤，滤液用PBST稀释5倍待测。

1.7 样品的检测

对于2种样品采用对待测物（SMZ）进行添加回收的方法，向鸡肉和鲫鱼2种阴性样品中分别添加3个不同含量水平（鸡肉添加 20、100、400 μg/kg；鲫鱼添加10、50、200 μg/kg）的 SMZ，按照 2.7 的样品预处理方法，提取后用胶体金试纸条进行检测。

1.8 稳定性试验

将制作好的试纸条置于4℃冰箱内密封保存。分别在 1、2、3、4、5、6 个月时取出进行一系列浓度标样的测定，每次3组，观察检测线和质控线的有无，条带的清晰度以及玻璃纤维释放金标抗体的程度。

2 结果

2.1 胶体金质量鉴定

胶体金溶液500 nm～600 nm的紫外扫描图谱，如图1。

图1 胶体金的500 nm～600 nm紫外扫描图Fig.1 Spectrum(500 nm-600 nm)of colloidal gold

只有一个最大的吸收峰λmax=525 nm，OD525=1.588，而且峰宽较小，波形光滑，说明制得的胶体金溶液的颗粒大小比较均匀。

用肉眼观察，可见胶体金溶液外观呈深红色，色泽均匀清亮，表面没有漂浮物。经胶体金电镜观察结果如图2。

图2 胶体金的电镜扫描图Fig.2 Transmission electron micrograph of colloidal gold

从图2可以看出所制备的胶体金颗粒大小均匀，最终测得的粒径平均大小（n=50）为40 nm。

2.2 检出限的确定

图3为在最佳的试验条件下检测不同浓度SMZ的结果示意图。

结果表明：随着SMZ浓度的升高，检测带逐渐变浅。当SMZ浓度低于1 μg/L时，检测线显色结果与空白溶液（不含SMZ）相比无法通过目测区别，当SMZ的浓度为1 μg/L，颜色与空白溶液虽然很接近，但仍能通过目测将两者区分，因此胶体金免疫层析法检测SMZ的方法检出限为1 μg/L。

图 3 GICA 实验结果（SMZ 浓度从左至右为：0、1、5、20 μg/L）Fig.3 Detection by GICA(the concentration of SMZ from left to right:0,1,5,20 μg/L)

2.3 样品的测定

向鸡肉和鲫鱼两种动物性食品中分别添加一定浓度的SMZ，结果如图4所示。

图4 SMZ试纸条对2种样品的添加回收实验结果Fig.4 Determination of SMZ in four spiked samples

由图4表明：对于2种样品，当添加SMZ浓度分别为20 μg/kg和10 μg/kg时，检测带颜色能通过目测与空白区分。能够满足我国及国外所规定的磺胺二甲基嘧啶在所有可食用组织和奶中最高残留限量（20 μg/kg）的要求。且由图4可看出，添加不同浓度SMZ的样品都可以得到明显的梯度，说明所优化的提取方法有效，适合现场快速检测。

2.4 稳定性试验

试纸条在4℃条件下放置6个月仍然稳定可靠，梯度明显，结合释放垫释放完全，条带清晰，试纸条具有很好的稳定性。6个月后稳定性开始下降，整体颜色变浅，不能正确判定检测结果，因此无法用于样品的检测。最后确定SMZ试纸条的保存条件是在4℃干燥的条件下密封保存，有效期至少6个月。

3 结论与讨论

采用柠檬酸三钠还原法制备了40 nm胶体金，标记抗磺胺二甲嘧啶多克隆抗体，优化建立了免疫胶体金快速检测方法，选取鸡肉和鲫鱼两种动物性食品，在2种样品中SMZ的检测限分别达到20 μg/kg和10 μg/kg，均满足国内外规定的磺胺二甲基嘧啶最高残留限量的要求。通过稳定性实验，确定SMZ试纸条的保存期限为4℃下密封干燥保存6个月，为进一步研发磺胺类兽药残留检测试剂盒提供参考。样品前处理方法以及测定过程快速，简便，检测方法特异性强，灵敏度高，适用于动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留的大批量现场检测，在今后的兽药残留检测领域将会发挥越来越重要的作用。

[1]Sashenbrecker PW,Fish NA.Sulphamethazine residues in uncooked edible tissues of pork following recommended oral administration and withdrawal[J].Canadian journal of comparative medicine,1980,44(3):338-345

[2]Printhipal Singh.Enzyme immunoassay for screening of suifamethazine in swine[J].Agric Food Chem,1989,37(1):109-114

[3]王曼霞,林黎明,刘心同,等.高效液相色谱法测定动物组织中8种磺胺类药物残留量[J].化学分析计量,2004,13(2):14-16

[4]严华,申厚凤.胶体金免疫层析技术的应用与展望[J].微生物学免疫学进展,2005,33(3):86-89

[5]Frens G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solution[J].Nature physical science,1973(105):20-22

Development of Rapid Detection Assay for Sulphamethazine Residues in Animal Foods

ZHANG Jia-yi
（Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

The objective of the study is to establish a competitive assay based on the principle of immunoassay for the rapid on-site detection of Sulphamethazine(SMZ)residues in chicken and fish muscle.The SMZ-OVA and goat anti-rabbit IgG were dispense on test line and control line respectively and the polyclonal antibody was solidified to glass fibers to prepare immunochromatographic strips.The visual detection limit for SMZ is 1 μg/L.The test strip was used to detect SMZ from chicken and fish muscle samples spiked with SMZ standard solution.The method established is sensitive,the reagent is innocuous and free from contamination and that the procedure of determination is simple and quick,costing 10 minutes.It was proved to be widely used to detect the SMZ residues in animal foods on-site.

colloidal gold;immunochromatographic;SMZ;rapid detection

张佳宜（1983—），女（汉），实验师，硕士研究生，研究方向：化学、食品安全。

2011-12-27