黄芩茎叶中活性成分野黄芩苷的微波提取工艺

张慧，李媛，徐倩文，陈芳

（中国农业大学食品科学与营养工程学院；果蔬加工教育部工程研究中心；农业部果蔬加工重点实验室，北京 100083）

黄芩茎叶中活性成分野黄芩苷的微波提取工艺

张慧，李媛，徐倩文，陈芳*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院；果蔬加工教育部工程研究中心；农业部果蔬加工重点实验室，北京 100083）

对微波法提取黄芩茎叶中主要活性成分野黄芩苷的工艺进行了研究，探讨目数、料液比、乙醇浓度、提取功率、提取时间各因素对提取率的影响。采用响应面分析法（response surface method，RSM）确定了微波提取的最佳工艺。结果显示，当乙醇浓度为40%，提取时间2.58 min，提取功率500 W时，野黄芩苷的提取率可以达到5.35%，并且该工艺有很好的重现性。

黄芩茎叶；野黄芩苷；微波提取；响应面法

黄芩为唇形科多年生草本植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根[1]，目前主要以其根作为传统药用，而产量数倍于根的茎叶部分被大量废弃，造成药用资源的浪费。有研究表明，黄芩茎叶中含有丰富的黄酮类化合物，具有较强的抗炎、抗氧化、抗缺氧、和记忆改善作用[2-4]。野黄芩苷为其中含量最丰富的黄酮化合物单体，而目前关于野黄芩苷的提取主要是采用中药半枝莲和灯盏细辛作为原料[5-7]。本文以黄芩茎叶作为提取原料，采用微波辅助提取工艺，通过响应面分析法得到最优提取参数，在此条件下得到较高野黄芩苷提取率，对于充分的利用中药资源，扩充黄酮类化合物的来源有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄芩茎叶：大兴安岭林格贝有机食品有限责任公司；野黄芩苷对照品（>95%）：上海同田生物技术有限公司；色谱乙腈：美国Honeywell公司；色谱甲酸：德国Sigma-Aldrich公司；分析纯乙醇：北京化学试剂有限公司。

MAS-Ⅱ型常压微波合成/萃取反应工作站：上海新仪微波化学科技有限公司；Waters 2695 HPLC色谱仪：美国；SHB型循环水式多用真空泵：郑州市上街华科仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 黄芩茎叶中野黄芩苷含量的测定

1.2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取野黄芩苷对照品（>95%）10.00mg于10mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容摇匀，得到浓度为1 mg/mL的野黄芩苷对照品溶液。

1.2.1.2 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm；5.0 μm）；柱温 30 ℃；流速 0.8 mL/min；进样量10 μL；检测波长为335 nm；流动相A为0.5%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱程序：0～5 min（B：20%）；5 min～10 min（B：20→25%）；10 min～12 min（B：25→30%）；12min～15min （B：30→50%）；15min～17min（B：50→30%）；17min～18min（B：30→20%）；18min～20min（B：20%）。

1.2.1.3 野黄芩苷标准曲线的制备

取适量野黄芩苷标准对照液，加入适量50%乙醇溶液，配制成浓度为 2.5、5、10、20、25、50 μg/mL 的系列标准溶液。以浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。得到回归方程Y=150.63X-364.48，R2=0.9992，表明野黄芩苷在2.5μg/mL～50μg/mL范围内线性关系良好。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 原料目数对野黄芩苷提取率的影响

原料经粉粹过筛，得到0～40目、40目～80目、80目～120目及120目以上的不同目数原料颗粒，精确称取上述原料各1.000 g，加入50 mL提取溶剂50%乙醇水溶液，于提取功率400 W提取1 min。样品经抽滤后定容至50 mL，测定提取液中野黄芩苷含量。

1.2.2.2 乙醇浓度对野黄芩苷提取率的影响

精确称取黄芩茎叶粉末样品（80目～120目）1.000g，分别添加30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液50 mL，于提取功率400 W提取1 min。样品经抽滤后定容至50 mL，测定提取液中野黄芩苷含量。

1.2.2.3 料液比对野黄芩苷提取率的影响

精确称取黄芩茎叶粉末样品（80目～120目）1.000g，分别添加 50%乙醇水溶液 10、20、30、40、50 mL，于400、700 W分别提取5 min，样品经抽滤后定容，测定提取液中野黄芩苷含量。

1.2.2.4 提取功率对野黄芩苷提取率的影响

精确称取黄芩茎叶粉末样品（80目～120目）1.000g，分别添加50%乙醇水溶液50 mL，于提取功率300 W～700W分别提取1、3、5min，样品经抽滤后定容至50mL，测定提取液中野黄芩苷含量。

1.2.2.5 提取时间对野黄芩苷提取率的影响

精确称取黄芩茎叶粉末样品（80目～120目）1.000g，添加50%乙醇水溶液50mL，分别于300、500、700W下提取 1、2、3、4、5、6、7 min，样品经抽滤后定容至 50 mL，测定提取液中野黄芩苷含量。

1.2.3 响应面法对野黄芩苷提取条件进行优化

综合单因素试验结果，根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，采用响应面法在三因素三水平上对黄芩茎叶中野黄芩苷的提取条件进行优化[8]。试验因子和水平见表1。

表1 响应面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 数据分析

统计分析采用Origin 8.0；响应面分析采用Design-Expert 8.0。

2 结果与分析

2.1 单因素试验各个因素对提取率的影响

2.1.1 原料目数对黄芩茎叶中野黄芩苷提取率的影响原料目数对黄芩茎叶中野黄芩苷提取率的影响见图1。

图1 不同目数对野黄芩苷提取率的影响Fig.1 Effects of different meshes of raw material on yield of scutellarin

原料目数不同，即原料与提取溶剂接触面积不同，将直接影响到提取效果。结果表明，随着目数的增加，野黄芩苷的提取率明显增加，这是因为颗粒越小，越有利于传质，有效成分越容易溶出，提取率自然会增加。但考虑到原料目数越大，粉碎成本越高，且不利于后续的纯化，综合考虑，我们最终选定原料的目数范围为80目～120目。

2.1.2 乙醇浓度对黄芩茎叶中野黄芩苷提取率的影响

乙醇浓度对黄芩茎叶中野黄芩苷提取率的影响见图2。

图2 不同乙醇浓度对野黄芩苷提取率的影响Fig.2 Effects of different ethanol concentration on yield of scutellarin

黄酮类物质易溶于有机溶剂，考虑到乙醇的无毒性，试验均以乙醇为提取溶剂。结果表明，随着乙醇浓度的升高，野黄芩苷提取率呈现先增加后减小的趋势，当乙醇浓度达到95%时，野黄芩苷提取率显著降低，一方面可能是因为随乙醇-水体积分数的变化，溶剂的极性大小随之变化，对不同成分的溶出发生变化，另一方面可能是因为高浓度乙醇使细胞内蛋白质变性凝固，黄酮不易溶出；观察提取液外观颜色可以看出，随着乙醇浓度增加，提取液颜色逐渐由黄褐色转变成鲜艳绿色，说明脂溶性叶绿素渐渐被提取出，这对后续纯化带来了一定的不便。最后确定50%乙醇为最佳提取溶剂浓度。

2.1.3 料液比对黄芩茎叶野黄芩苷提取率的影响

料液比对黄芩茎叶野黄芩苷提取率的影响见图3。

图3 不同料液比对野黄芩苷提取量的影响Fig.3 The effects of solid to liquid ratio on yield of scutellarin

由图3可知，随着料液比的增加提取率随之增加，于 1:50（g/L）达到最大值，这是因为，通常情况下，当样品量一定，增加溶剂的量可以降低药材颗粒周围的浓度，使细胞壁内外两侧的浓度差增大，从而加速有效成分的扩散，有利于成分的溶出。由于料液比过大不利于后续的分离纯化，我们没有再进行更大料液比的试验。最后选定料液比 1:50（g/L）。

2.1.4 提取功率对黄芩茎叶中野黄芩苷提取率的影响提取功率对黄芩茎叶中野黄芩苷提取量的影响结果见图4。

图4 提取功率对野黄芩苷提取率的影响Fig.4 The effect of irradiation power on yield of scutellarin

随着功率的增加，提取量达到最大值所需时间逐渐减小，当提取功率较低时（300 W），5 min的提取量显著高于1 min，而当提取功率增大到700 W时，3 min与5 min的野黄芩苷提取量基本相同。统计分析表明：提取时间为1 min时，300 W与400 W差异不显著，500 W分别与400 W、600 W差异不显著，600 W与700 W差异不显著（p>0.05），其余处理之间差异显著；提取时间为3 min时，500 W分别与300 W、400 W、600 W差异显著（p<0.05），其余处理之间差异不显著；提取时间为5min时，300W与700W，400W与500W、600 W之间差异不显著（p>0.05），其余其余处理之间差异显著。

2.1.5 提取时间对黄芩茎叶中野黄芩苷提取率的影响

提取时间对黄芩茎叶中野黄芩苷提取率的影响结果如图5所示。

图5 提取时间对野黄芩苷提取量的影响Fig.5 The effect of extraction time on yield of scutellarin

随着提取功率的增加，野黄芩苷提取率达到最大饱和值所需时间均逐渐减小，当提取功率为300 W时，提取率于5 min达到最大值；当提取功率为500 W时，提取率在3 min达到最大值；当提取功率为700 W时，提取率在2 min达到最大值。统计分析表明：提取功率为300 W时，1 min与各处理差异显著（p<0.05），2 min与5 min差异显著（p<0.05），其余各处理差异不显著（p>0.05）；提取功率为500 W时，1 min与各处理时间差异显著（p<0.05），其余各处理差异不显著（p>0.05）；提取功率为700 W时，1 min与7 min与其他各处理均差异显著（p<0.05），其余各处理时间差异不显著（p>0.05）。

2.2 响应面分析法对野黄芩苷提取工艺的优化

2.2.1 响应面试验结果与分析

通过上面单因素影响条件的研究，确定了最佳的试验条件范围，根据Box-Benhnken试验设计原理，选取微波提取时间（A）,提取功率（B）以及乙醇浓度（C）为变量，野黄芩苷提取率（Y1）为响应值。试验设计及结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Experiment design and results of response surface method

利用Design Expert 8.0软件进行回归分析，各因素经回归拟合后，得到提取时间、提取功率、乙醇浓度对微波提取量的二次多项回归方程：

Y1=5.19+0.17A-0.028B-0.15C-0.19AB-0.044AC+6.25×10-3BC-0.25A2-0.23B2-0.057C2

对模型进行显著性分析可知，模型的P值分别为0.0418，小于0.05，表明模型显著。失拟项p=0.0854＞0.05，失拟项不显著，表明方程对试验拟合程度好。试验因素一次项（A、C）、二次项（AB、A2、B2）对结果影响显著（p＜0.05），交互项（AC、BC）对结果影响不显著（p＞0.05）。在所选的因素水平范围内，各因素对结果的影响排序为：提取时间（A）＞乙醇浓度（C）＞提取功率（B）。根据回归方程作出响应面分析见图6。

图6 响应面法（时间，功率）立体分析图Fig.6 The analytical graph of response surface of the effect of powder and time

2.2.2 优化验证

通过Design Expert 8.0软件进行优化，得到优化的结果为提取时间2.59 min，功率470.93 W，乙醇浓度40%，在此条件下野黄芩苷提取率可达到5.34%。由于实验操作的可行性，将微波萃取的最佳条件修正为：提取时间2.6 min，提取功率500 W，乙醇浓度40%，在此条件下进行验证性度验，测得野黄芩苷提取率为5.35%，与理论预测值相对误差很小，说明该模型能很好的预测各因素与提取量之间的关系。

3 结论

应用响应面优化微波提取黄芩茎叶野黄芩苷的工艺，得到最佳工艺为：微波提取时间2.6 min，功率500 W,乙醇浓度40%。在次条件下，野黄芩苷提取率达到5.35%。该结果重复性强，具有重要的研究意义。

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Study on the Microwave Assisted Extraction of Active Component of Scutellarin from Stems and Leaves of Scutellaria

ZHANG Hui,LI Yuan,XU Qian-wen,CHEN Fang*
（College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University;Key Laboratory of Fruits Vegetables Processing;Engineering Research Center of Fruits&Vegetables Processing,Beijing 100083,China）

Study on the microwave assisted extraction of scutellarin from stems and leaves of scutellaria.Analyse the mesh,material liquid ratio,ethanol concentration and extracting power,extracting time for the influence of the extraction amount.Using the response surface method(RSM)to determine the best technology of microwave extraction.The results showed that when ethanol concentration was 40%,extracting time 2.58 min,extracting power 500 W,scutellarin can be achieved 5.35%.This process had very good reproducibility.

stems and leaves of scutellaria;scutellarin;microwave extraction;response surface method

北京市科技计划课题（D101105046610001）

张慧（1984—），女（汉），在读研究生，研究方向：天然产物提取。

*通信作者：陈芳，副教授。

2012-03-17