白血病细胞系NK细胞配体表达及其对NK-92细胞杀伤敏感性的研究①

罗 渊 索塔林 李 燕 葛淑静 周洪哲 唐 捷 段连宁

(中国人民解放军空军总医院临床航空医学实验室，北京100142)

白血病的根本治愈手段主要是造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)，然而白血病复发仍是临床面临的最大难题。虽然针对白血病的生物免疫疗法如供者淋巴细胞输注(DLI)或者供者自然杀伤细胞输注(DNKI)可以解决部分移植后复发问题［1］，但是，白血病患者复发后对免疫治疗的敏感性仍然非常低下，严重限制免疫治疗的开展。

有学者发现，当供者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)与受者的KIRs配体不相合时，可以诱发NK细胞的同种异体反应活性［2］。清除T细胞后的移植物中含有的有同种异体反应活性的NK细胞可增强移植物抗白血病(GVL)的效应，并且极大地降低移植物抗宿主病(GVHD)的发生［3］。NK细胞表面表达一系列的受体，可分为激活性受体和抑制性受体两大类，其对靶细胞的杀伤与否取决于两类受体与相应配体结合后的信号整合［4-6］。本研究以一种成功建系的NK细胞——NK-92细胞为效应细胞，通过研究7种白血病细胞系的10种NK配体表达情况及其被NK-92细胞杀伤情况，分析白血病细胞NK配体表达与NK敏感性的相关性。

1 材料与方法

1．1 细胞系 人NK-92细胞株，人急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞株CEM、Reh和LCL，以及人急性髓系白血病(AML)细胞株 U937、KG-1a、HL-60和NB4均为合作单位中国科学院生物物理研究所常规保存。NK-92细胞的全培养基为含2 mmol/L L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠、0.2 mmol/L肌醇、0.1 mmol/L 2-巯基乙醇、0.02 mmol/L叶酸、100～200 U/ml重组IL-2、12．5%胎牛血清和12．5%马血清的α-MEM培养液。白血病细胞系的全培养基为含10%胎牛血清的1640培养液。依据细胞浓度，每2～3天换液或传代。

1．2 主要试剂与仪器 RPMI1640细胞培养液、α-MEM细胞培养液、特级胎牛血清(Gibco)，Trizol(Invitrogen公司)，引物合成(上海生工)，DNA聚合酶、DNA Marker(TaKaRa公司)，荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)和碘化丙啶(PI)购自Sigma公司，核酸电泳仪(Bio-Rad)，凝胶成像系统(美国UVP公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。

1．3 流式细胞术检测NK-92细胞杀伤实验 收集白血病细胞系，用无血清1640洗涤两次，细胞计数后用37℃培养基重悬浓度至 5×107个细胞/ml。接着加入CFSE，使其终浓度为2 μmol/L，在37℃孵育15分钟，注意避光、不时混匀，进行靶细胞染色。加入5倍体积、冰预冷的1640完全培养基以终止反应。同时，将效应细胞NK-92用无血清α-MEM细胞培养液洗涤一遍，对效靶细胞分别计数，将效靶比(E∶T)设为4∶1，混合后于37℃孵育3小时。收集细胞，加入PI进行死亡细胞染色。同时设置单独效应细胞、单独靶细胞和0小时混合细胞作为对照，用流式细胞仪进行检测。CFSE阳性的为染色的靶细胞，而CFSE和PI双阳性则为被NK-92杀伤的靶细胞，靶细胞杀伤率=(实验组CFSE和PI双阳性细胞数/实验组CFSE阳性细胞数－对照组CFSE和PI双阳性细胞数/对照组CFSE阳性细胞数)×100%。

1．4 NK配体表达的半定量RT-PCR检测 常规培养以上7种白血病细胞系，至合适密度时收集细胞，按Trizol试剂盒说明书操作提取细胞总RNA，分装后冻存于－80℃。用Oligo(dT)做逆转录反应，特异性地把mRNA逆转录成cDNA，接着用设计的引物分别扩增目的基因和内参基因，引物序列和扩增目的条带大小如表1所示。PCR过程为:94℃变性5分钟后，94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒顺序循环30次，最后72℃延伸5分钟。PCR产物经电泳、拍照后，用Gel Pro 4．0软件分析各条带光密度值，目的基因表达值=目的条带光密度值/β-actin光密度值。

1．5 统计学分析 采用SPSS17．0软件包进行统计分析。计量资料以x±s表示。白血病细胞系NK-92杀伤率或NK配体表达水平的组间比较采用多个独立样本比较的秩和检验，P＜0．05为差异有显著性。

2 结果

2．1 采用流式细胞术的方法检测NK-92细胞对白血病细胞的杀伤效应，结果见图1、表2。结果可见，NK-92细胞对以上细胞系的杀伤作用分别为(21．00±1．17)%、(21．93 ± 3．00)%、(10．87 ± 0．52)%、(5．58±0．78)%、(4．89 ± 0．61)%、(0．69 ±0．41)%、(0．67 ±0．40)%。根据 NK-92 细胞对靶细胞的杀伤效应强弱，将以上7种白血病细胞系分成NK敏感组(U937、CEM、KG-1a)、NK中度敏感组(HL-60、NB4)和不敏感组(Reh、LCL)，组间比较的P=0．003，差异具有统计学意义。

表1 NK配体和内参基因的扩增引物Tab．1 Primers for the detection of NK ligands and control gene

图1 流式细胞术检测NK-92细胞对白血病细胞系的杀伤效应Fig．1 The sensitivity of leukemia cell lines to NK-92 detected by FCM

表2 白血病细胞NK配体表达水平及其NK-92敏感性Tab．2 Relative expression of NK ligands on leukemia cells and their sensitivity to NK-92

2．2 采用半定量RT-PCR的方法检测白血病细胞系的NK配体。由于电泳图片较多，在此只列出已换算成光密度比值的结果，见表2。结果表明，PVR(CD155)和HLA-F在组间的差异具有统计学意义，NK-92不敏感组的PVR转录水平最低而HLA-F的最高，其他配体间则无显著性差别。

3 讨论

NK-92细胞是Klingemann实验室于1992年从一名恶性非霍奇金淋巴瘤患者外周血分离并成功建系的大颗粒淋巴细胞［7］。NK-92与普通NK细胞一样，识别靶细胞无MHC限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞。而且，NK-92细胞几乎不表达常见的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)，如2DS1-5、2DL1-3、3DL1-2 和 3DS1 等，而只表达唯一的2DL4［8］。该受体胞浆区含有一个免疫酪氨酸抑制基序(ITIM)，但是跨膜区含有一个带正电的精氨酸残基，也有可能结合伴随分子而传递激活性信号，因此2DL4同时具有抑制性受体和激活性受体的特征。正因为NK-92细胞不表达大部分KIRs，所以不能识别HLA-A、B、C等经典的MHCⅠ类分子，从而类似于“丢失自我”(Missing self);同时，NK-92细胞表达一系列与杀伤功能密切相关的NK激活性受体、协同活化受体和凋亡诱导受体等，如NKG2D、NKp30、NKp46、LFA、2B4、DNAM-1、FasL、TRAIL 等，而抑制性受体的表达较少，仅见ILT-2、NKG2A/B，因此，NK-92细胞具有很高的杀细胞活性和很广的靶细胞谱［8，9］。

本研究分别检测了7种白血病细胞系的10种NK配体，其与NK受体的对应关系见表3。从结果可见，NK敏感组、中度敏感组和不敏感组的激活性配体PVR和抑制性配体HLA-F的转录水平有显著性差异，而其它配体组间均没有显著性差异。其中，NK不敏感组的PVR水平(激活性配体)明显低于其他两组，HLA-F水平(抑制性配体)明显高于其他两组，而NK敏感组与中度敏感组间的差异不显著。初步表明，PVR和HLA-F这两个配体在白血病细胞系对NK细胞杀伤的耐受机制中发挥了重要作用，而其他八种配体的转录水平则有高有低，没有明显的规律性。

表3 NK受体与配体的对应关系Tab．3 The corresponding relationship between NK receptors and ligands

NK细胞属于固有免疫系统，是机体抵抗肿瘤和感染的第一道防线。在血液系统肿瘤的免疫监视中发挥主要作用的NK细胞杀伤活性相关受体主要包括自然细胞毒受体(NCRs)、自然杀伤组2成员D(NKG2D)和 DNAM-1［10］。因此，为了逃逸 NK 细胞的免疫监视，白血病细胞进化出了若干的手段，如下调表达激活性配体、激活性配体从细胞膜脱落成游离态、高表达抑制性配体等［9］。本研究的结果显示，NK耐受组细胞采用的逃逸策略是低表达DNAM-1的配体PVR的同时高表达抑制性受体LIR2的配体HLA-F。Pende等学者发现，髓源性白血病常持续表达DNAM-1的配体(PVR、Nectin2)，而淋巴系白血病的表达更少［11］。本研究中低表达PVR的两种细胞系均是淋巴系来源，而Nectin2的表达差别则不显著。HLA-F分子是非经典的HLA-Ⅰ类分子，通常表达于细胞浆内，接受一定的信号后则表达在细胞膜上，被认为是淋巴细胞活化的表面标志［12］。本研究表明，肿瘤细胞提高表达 HLA-F可能也是一种重要的逃逸机制。

国外有学者认为，B系急性淋巴细胞白血病细胞对NK细胞耐受的机制主要为缺乏足够的激活性信号，而与抑制机制无关［13］。而在本研究中，我们发现一个有趣的结果，NK不敏感组细胞在降低激活性信号的同时，也提高抑制性信号，从而大大增强了其对NK细胞的抵抗能力。通过本研究，我们初步找出了人为干预肿瘤细胞耐受NK细胞的两个靶点分子(PVR和HLA-F)，为后续的工作打下了基础。但是，本研究也存在一定的局限性，如本研究采用的半定量PCR法准确性不高，在后续工作中应用实时定量PCR和流式细胞术进行验证。而且本研究的NK配体数量有限，若能进行大规模、全面的配体检测，将会得出更有意义的数据。肿瘤的NK细胞免疫治疗是一个很有前景的发展方向［14］，只有在充分了解NK细胞活化机制的基础上，才能针对不同肿瘤进行不同的人为干预，使生物治疗的疗效最大化，更好地服务于人类的健康事业。

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