HIF-1α、MT、Slug和E-cadherin在人乳腺癌中的表达及其意义①

龙方懿 印国兵 刘智敏 杨俊艳 贾朝莉 刘小花 董超然 王 旎

(重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，重庆400016)

乳腺癌在全球范围内一直位居女性恶性肿瘤的首位，且呈逐年上升趋势，大大危害着女性健康，乳腺癌的发展受多因素的调控。

在肿瘤细胞增殖过程中，缺氧是实质性肿瘤物理微环境的基本特征之一［1］，细胞对缺氧的反应主要是由低氧诱导因子1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)来调节的。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两个亚基构成，HIF-1β组成性表达，而HIF-1α作为氧调节亚基，决定着HIF-1的活性，HIF-1α的过表达与肿瘤的侵袭转移密切相关［2］。金属硫蛋白(Metallothioneins，MTs)是一类低分子量高半胱氨酸含量的非酶金属结合蛋白质家族，在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥着重要的作用。钙黏蛋白E(E-cadherin)是钙依赖性介导细胞间连接的黏附分子，其表达的下调或丧失是大多数肿瘤细胞的特征之一，而Slug作为Snail锌指转录因子家族成员，可通过与E-cadherin启动子的E-box结合，下调E-cadherin的表达进而促进肿瘤的侵袭转移［3］。

目前，有关 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在乳腺癌中的表达及其相关性研究报道甚少，本研究通过采用免疫组化SP法与RT-PCR检测乳腺癌中HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在蛋白水平和mRNA水平的表达情况，进而探讨HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin能否作为监测乳腺癌发展的指标。

1 材料与方法

1．1 材料 69例2009年2月～2010年10月手术后经病理诊断为乳腺癌的组织标本来自于重庆医科大学附属第二医院普外科。按WHO乳腺肿瘤组织学类型分类标准:浸润性导管癌48例，浸润性小叶癌21例。依据国际抗癌联盟(UICC)乳腺癌TNM分期标准(2003):Ⅰ期3例，Ⅱ期48例，Ⅲ期18例，Ⅳ期0例。所有患者均是女性，年龄26～79岁，中位年龄49岁，全部患者术前未接受放疗、化疗及激素治疗。人乳腺癌细胞系MCF-7与MDA-MB-231均来自于本实验室。

1．2 主要试剂 鼠抗人Slug单克隆抗体为Santa Cruz公司产品;鼠抗人MT单克隆抗体为Abcam公司产品;兔抗人HIF-1α多克隆抗体为Millipore公司产品;兔抗人E-cadherin多克隆抗体、DAB试剂盒和免疫组化SP法试剂盒均购于北京中杉金桥公司;总RNA提取RNAiso Plus、逆转录酶试剂盒、Premix Taq DNA酶购自TaKaRa公司;RT-PCR引物由TaKaRa公司合成。

1．3 实验方法

1．3．1 免疫组化SP法 采用链霉亲和素-过氧化物酶法(SP法)。标本均经过10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，切片分别作免疫组化染色和HE染色，免疫组化SP法及DAB显色操作步骤均按照说明书进行。用已知阳性切片作阳性对照，用PBS替代一抗作阴性对照。

1．3．2 细胞培养 人乳腺癌 MCF-7与 MDA-MB-231细胞贴壁培养于含10%新生小牛血清(四季青公司)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基(美国Hyclone公司)中，置37℃、5%CO2饱和湿度孵箱常规传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1．3．3 细胞总 RNA 提取 按照 RNAiso Plus(TaKaRa公司)试剂说明书要求操作，分别提取人乳腺癌MCF-7与MDA-MB-231细胞总RNA，所提取的总RNA用紫外分光光度计(Bio-Rad)定量并检测其纯度，纯度为OD260/OD280≥1．8的总RNA提取物用于后续试验。

1．3．4 RT-PCR PCR 引物序列见表1，RT-PCR 反应按说明书进行，反应产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳并拍照，以DL1000 DNA Maker(TaKaRa公司)为参照，采用Quantity One软件对RT-PCR检测结果进行图像分析。

1．4 结果判定 免疫组化实验结果采用半定量法进行判定:光镜下每张切片选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞，胞核、胞浆或胞膜染色为棕黄色或深棕黄色的细胞为阳性细胞，计算每张切片5个高倍视野中阳性细胞的平均百分率，阳性细胞平均百分率＜10%为阴性表达病例，阳性细胞平均百分率≥10%为阳性表达病例。

PCR反应产物进行电泳后用凝胶成像系统(Bio-Rad)扫描各电泳条带的平均光密度值并测量其面积，获得几何平均光密度。基因表达用相对光密度表示:检测基因光密度/管家基因光密度。

表1 目的基因HIF-1α、MT、Slug及E-cadherin和内参基因GAPDH的PCR引物序列及产物长度Tab．1 The primer sequences and product length of target genes HIF-1α，MT，Slug，E-cadherin and internal control gene GAPDH

1．5 统计学分析 计量资料以x±s表示，应用SPSS18．0统计软件对数据进行统计学处理。采用χ2检验、Spearman等级相关分析和独立样本t检验，P＜0．05具有统计学意义。

2 结果

2．1 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在人乳腺癌组织中的表达 在69例乳腺癌组织中，HIF-1α阳性表达率为71．01%(49/69)，在胞浆和胞核均有表达(如图1E);MT的阳性表达率为 42．03%(29/69)，在胞浆和胞核内都有表达(如图1F);Slug阳性率为43．48%(30/69)，其阳性表达定位于胞浆和胞核(如图1G);E-cadherin阳性表达率为50．72%(35/69)，主要在细胞膜上表达(如图1H)。

由表2可知，HIF-1α、Slug和 E-cadherin的阳性表达对于TNM分期和腋淋巴结转移均有显著性差异(P＜0．05)，而对于年龄、肿瘤大小及病理类型(浸润性导管癌或浸润性小叶癌)，均无显著性差异(P＞0．05)。MT的阳性表达对于TNM分期具有显著性差异(P＜0．05)，而对于年龄、肿瘤大小、腋淋巴结转移及病理类型(浸润性导管癌或浸润性小叶癌)均无显著性差异(P＞0．05)。

图1 乳腺癌组织标本中HIF-1α、MT、Slug和E-cadherin的表达(SP法，×400)Fig．1 The expression of HIF-1α，MT，Slug and E-cadherin in breast cancer tissue(SP method，×400)

表2 HIF-1α、MT、Slug和E-cadherin在乳腺癌中的表达及与临床病理特征的关系Tab．2 Expression of HIF-1α，MT，Slug and E-cadherin in breast cancer and its relationship with clinical pathological characteristics of breast caner

2．2 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在人乳腺癌组织中表达的相关性 经Spearman等级相关分析，在69例乳腺癌组织标本中，HIF-1α与MT蛋白的表达呈显著正相关(r=0．285，P ＜0．05)，MT 与 Slug的表达呈显著正相关(r=0．379，P ＜0．01)，Slug和 E-cadherin的表达呈显著负相关(r=－0．422，P＜0．01)，见表3。

2．3 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在人乳腺癌细胞系MCF-7与MDA-MB-231中的表达 提取MCF-7与MDA-MB-231细胞总RNA，RT-PCR方法分析在 MCF-7与 MDA-MB-231细胞中 HIF-1α、MT、Slug及E-cadherin mRNA的相对表达水平。PCR产物凝胶电泳结果显示，在MCF-7与MDA-MB-231细胞中都存在 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin mRNA 的表达，HIF-1α、MT、Slug mRNA 在恶性程度更高的MDA-MB-231细胞中表达高于 MCF-7细胞(P＜0.01)，而E-cadherin mRNA在MDA-MB-231细胞中的表达低于MCF-7细胞(P＜0．01)，如图2。

表3 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在人乳腺癌组织中表达的相关性Tab．3 Correlation between HIF-1α，MT，Slug andE-cadherin expression in breast cancer tissues

图2 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin RT-PCR 产物凝胶电泳条带图及RT-PCR半定量表达的比较Fig．2 RT-PCR product gel electrophoresis and semi-quantitative expression of HIF-1α，MT，Slug and E-cadherin

3 讨论

在实体肿瘤的发生发展中，由于肿瘤的快速生长，肿瘤新生血管供血不足导致局部缺氧，从而诱导HIF-1α表达，被上调的HIF-1α作为转录因子可以调节多种下游基因，进而增强肿瘤的侵袭转移，以逃避或适应相对低氧的环境。HIF-1α在一系列人类肿瘤中表达上调，并且在一些癌前病变组织中HIF-1α也被检测到存在，提示HIF-1α的表达可能是肿瘤进展中的早期事件。一般认为在正常组织中锌、铜和镉等金属离子及一些内源性因子能够诱导MT的合成，但在癌细胞中MT合成的机制尚不清楚，有文献报道在癌组织中HIF-1α能上调MT的表达，MT的生物学功能不仅在于重金属解毒，在调控癌细胞生长和增殖方面也有重要作用，MT可能是肿瘤进展性生物学行为的一个标志物。近年来转录因子Slug在肿瘤转移中的作用越来越受到人们的关注，在脑胶质瘤、乳腺癌和前列腺癌等多种恶性肿瘤中存在明显上调［4-6］。一方面，低氧激活HIF-1α可以上调 Slug的表达;另一方面，Slug可以下调E-cadherin的表达。E-cadherin是一种重要的阻止肿瘤细胞脱离原发灶的肿瘤转移抑制因子，人E-cadherin启动子E-box含有5'-CACCTG序列，为含helix-loop-helix(HLH)转录因子家族的结合位点，Slug能与此结合位点结合，进而下调E-cadherin的表达，促进肿瘤的侵袭转移［3］。

在本研究的69例乳腺癌组织中，HIF-1α的表达与TNM分期及腋淋巴结转移显著相关，表明乳腺癌组织TNM分期越高，组织细胞内缺氧越严重，且乳腺癌组织中HIF-1α的表达可能有利于癌转移。Spearman等级相关分析显示，HIF-1α与MT的表达呈显著正相关，说明HIF-1α与MT可能存在一定的内在联系，MT蛋白在多种实体肿瘤及其黑色素瘤和急性淋巴白血病中表达增加，有研究显示，低氧可诱导前列腺癌细胞表达MT，促进细胞增生，siRNAMT可抑制低氧诱导的细胞增生并诱导凋亡［7］;HIF-1是低氧诱导鼠表达MT所必需的［8］。这些研究表明肿瘤组织MT过表达与低氧激活HIF-1有关，HIF-1作为转录因子上调MT的表达。另一方面，近期研究显示MT可增加HIF-1α的稳定性，进而增强 HIF-1 的转录活性［9，10］，两者表现出相互促进作用。在本次研究中，随着TNM分期的增高MT表达增加，表明MT的表达可能有利于乳腺癌的发展。通过对MT及Slug相关性分析，我们发现它们在乳腺癌组织中的表达呈显著正相关，有研究显示，MT可与细胞内多种含锌蛋白和转录因子在空间上直接相互作用，提供锌离子调节含锌蛋白和转录因子的活性［11］，Slug也是一种锌指转录因子，最初在背部神经管中被发现，参与神经胚的形成与神经干的正常发育［3］，后来发现在胰腺癌中低氧能使Slug表达上调，与肿瘤侵袭转移密切相关［12］。我们推测低氧诱导产生的MT可能与Slug有直接相互作用，提供锌离子调节Slug转录活性。在本研究中我们还发现Slug与E-cadherin的表达具有显著的负相关。Uchikado等［13］在研究弥散性胃癌和食管鳞状细胞癌中发现Slug的表达与E-cadherin下调相关，这与本次研究结果一致。Slug含有可与E-cadherin启动子E-box基序结合的结构域，作为转录抑制因子结合到E-cadherin启动子上抑制E-cadherin基因的转录，Slug的表达上调与上皮-间质细胞转变、肿瘤的侵袭转移密切相关，而E-cadherin在恶性肿瘤的发生发展过程中具有抗转移功能，癌细胞可以通过多种机制抑制E-cadherin的表达，使癌细胞易于脱离原发灶发生侵袭转移，在间质样浸润性癌和浸润性乳腺癌等侵袭性肿瘤中，E-cadherin表达下调有利于肿瘤的侵袭转移［14，15］。在本研究中的69例乳腺癌组织中，Slug与E-cadherin的表达均与TNM分期和腋淋巴结转移显著相关，表明Slug与E-cadherin表达可能有利于乳腺癌发生浸润转移。通过RT-PCR 发现，HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞中均有表达，且在恶性程度更高的MDA-MB-231细胞中，HIF-1α、MT、Slug mRNA表达更高，E-cadherin mRNA表达更低，差异具有显著性(P ＜0．05)。表明 HIF-1α、MT、Slug及E-cadherin的表达情况与乳腺癌的发展有一定关系，HIF-1α、MT、Slug的高表达与 E-cadherin的低表达有利于肿瘤恶性程度的增加，这与免疫组化的结果一致。

通过本次研究及相关文献，我们推测:在乳腺癌中肿瘤低氧微环境可以激活HIF-1。一方面，HIF-1可以上调MT的表达;另一方面，MT可以增加HIF-1α的稳定性，进而增强HIF-1的转录活性。被上调的MT可能与Slug有空间上的直接相互作用，提供锌离子给Slug并增强其活性，Slug作为转录抑制因子与E-cadherin启动子的E-box结合，下调E-cadherin的表达，进而增强肿瘤的侵袭与转移能力，但具体的分子机制还有待于进一步研究。由于HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在乳腺癌中的表达相关性及其与临床病理特征的密切关系，可初步认为HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在乳腺癌中的表达情况可以作为监测乳腺癌发展的指标。

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