阿托伐他汀抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞表达胸腺基质淋巴细胞生成素TSLP的表达①

昌 薇 何少林 林 静 赵 卉 李大主

(华中科技大学同济医学院协和医院心内科，武汉430022)

现有研究证实动脉粥样硬化(AS)为一慢性免疫炎性疾病，血管内皮细胞在经受多种危险因素(如ox-LDL)的刺激、损伤后表达多种炎性介质，激活并诱导各种免疫炎症细胞(如巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等)聚集于内膜下，参与粥样斑块的发生发展［1］。他汀类调脂药物可延缓和消退动脉粥样硬化病变，其机制主要是通过其调脂作用和一系列非调脂作用实现［2］。近期研究发现，阿托伐他汀可在体抑制冠心病患者树突状细胞的功能［3］，从而达到抗炎的作用，但这一作用的具体机制尚不明确。近年对新型细胞因子——胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的多项研究发现，其是树突状细胞最强烈的激活因子，在启动许多炎症性疾病的发病中起“总开关”的作用［4］，但其是否在动脉粥样硬化过程中起作用尚未见报道。我们近期研究发现，ox-LDL可刺激血管内皮细胞显著表达TSLP，在AS炎症反应的启动中可能发挥作用［5］。阿托伐他汀的免疫抑制和抗炎作用是否源于其对血管内皮细胞TSLP表达的抑制目前尚无研究，本文就此进行探讨。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 新生胎牛血清和DMEM培养基购于Gibco-RBL公司，按照说明书配制，4℃保存，血清在使用前用56℃水浴30分钟灭活补体后分装，－20℃保存;氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)购于Sigma公司;DMSO购于上海华美生物工程公司;Trizol试剂盒购于Gibco-RBL公司;逆转录试剂盒购于日本TOYOBO公司;实时定量试剂盒购于日本TSKARA公司;TSLP ELISA试剂盒购于Biolegend(San Diego，USA)公司;免疫荧光一抗试剂购于 Abcam(Cambridge，UK)公司，免疫荧光二抗试剂盒及DAPI购于博士德公司。阿托伐他汀为辉瑞公司提供的实验用药。

1．2 方法

1．2．1 内皮细胞的培养 人脐静脉内皮 HUVEC由华中科技大学同济医学院基础学院提供。用DMEM/F-12培养液(含10%灭活胎牛血清 ，100 U/L青、链霉素)在37℃、饱和空气湿度、含5%CO2的培养箱内常规传代培养。细胞长至约80%融合，倒去培养液，PBS洗2～3次，0．25%胰蛋白酶消化收集细胞，制成单细胞悬液。

1．2．2 实验分组 人脐带静脉内皮细胞培养72小时，按如下分组:(1)对照组:加入50 mg/L的ox-LDL后继续培养12小时;(2)阿托伐他汀处理低浓度组:加入 50 mg/L的 ox-LDL和阿托伐他汀1 μmol/L后继续培养12小时;(3)阿托伐他汀处理高浓度组:加入50 mg/L的ox-LDL和阿托伐他汀10 μmol/L后培养12小时;分别于6小时和12小时取上清和细胞检测。

1．2．3 ELISA检测上清液TSLP浓度 操作按试剂盒说明进行。

1．2．4 RT-PCR定量分析TSLP mRNA表达 ①用一步法提取细胞总RNA:提取的总RNA经电泳鉴定未被降解，用72-1分光光度计测RNA在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，根据260 nm的吸光度值对样品的总RNA进行初步定量。②逆转录反应:应用TOYOBO逆转录试剂盒配制20 μl反应体系，在T gradient梯度PCR仪进行逆转录反应得到cDNA。③RealTime RT-PCR应用TaKaRa实时定量试剂盒配制25 μl反应体系。TSLP的上游引物:TATGAGTGGGACCAAAAGTACCG;下游引物:GGGATTGAAGGTTAGGCTCTGG;内参照GAPDH的上下游引物如下;上游引物:CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA;下游引物:TCTAGACCGCAGGTCAGGTCCACC。在ABI Step one实时荧光定量PCR仪上扩增。TSLP mRNA相对表达水平用CT比较法2-△△CT表示。

1．2．5 免疫荧光染色检测细胞TSLP表达 在 6孔板内预置一盖玻片，接种HUVECs(1×106/孔)，ox-LDL和阿托伐他汀处理6或12小时后，将含有贴壁细胞的盖玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定20分钟，取出盖玻片固定于载玻片上，PBS洗3次;加5%BSA封闭液封闭30分钟，封闭非特异性抗原，吸取余液。PBS漂洗3次;吸去PBS液，滴加第一抗体(TSLP 1∶400浓度稀释)，每张切片加入50 μl稀释液，4℃过夜;PBS洗3次，吸去 PBS液，加入CY3-羊抗兔二抗(1∶50)孵育1小时后流水冲洗3分钟，PBS洗2次后加DAPI染细胞核5分钟，吸出余液后PBS洗3次，用缓冲甘油封片，立即激光共聚焦显微镜照相。阴性对照采用PBS代替一抗，其余步骤相同。用IPP软件对免疫荧光结果进行图像处理，TSLP阳性表达用平均积分光密度表示。

1．3 统计学处理 实验数据以x±s表示，结果均用SPSS13．0统计软件进行统计学处理。

2 结果

2．1 阿托伐他汀抑制HUVECs TSLP分泌 对照组6小时和12小时 的 TSLP浓度分别为(8．94±1．52)和(11．42 ±1．87)pg/ml(图 1)，表明 TSLP 的表达呈时间依赖性;阿托伐他汀低浓度组6小时与12小时的 TSLP 浓度为(7．02 ±0．82)，(9．55 ±1．24)pg/ml;阿托伐他汀高浓度组的TSLP浓度分别为(5．69 ±0．64)，(7．32 ±0．93)pg/ml;与同时间对照组比较，均显示TSLP浓度的有显著性下降，P＜0．001;低浓度组与高浓度组间亦有显著性下降，P＜0．01;并显示出剂量依赖性。

2．2 阿托伐他汀抑制HUVEC TSLP mRNA表达

经TSLPmRNA定量分析发现，对照组在6小时和12小时TSLPmRNA均有高表达(图2)，实验组和同时间对照组比较，TSLPmRNA均显示出显著性下降(P ＜0．001)，组间有显著性差异(P ＜0．01)及剂量依赖性。

图1 对照组和实验组上清液中的TSLP浓度Fig．1 Release of TSLP protein in cell supernatants in control group and atorvastatin groups

图2 对照组和实验组细胞内TSLP mRNA表达Fig．2 Release of TSLP mRNA by HUVECs in control group and atorvastatin groups

图3 HUVEC TSLP表达的免疫荧光染色(×400)Fig．3 Immunofluorescence staining analysis of the expression of TSLP in HUVEC (×400)

2．3 阿托伐他汀抑制HUVEC TSLP的表达 如图3所示，对照组HUVEC均显著表达TSLP，6小时和12小时的平均积分光密度分别为3．429±1．776，4．978±1．525;阿托伐他汀低浓度组在6小时和12小时的平均积分光密度为 3．397 ±1．141，4．803 ±1．614;其高浓度组为 3．256 ± 1．686，4．721 ±1．522，均见显著性抑制TSLP表达，与同时间对照组比较，均有显著性差异(P＜0．001)，组间亦有显著性差异(P ＜0．01)。

3 讨论

现有研究发现动脉粥样硬化(AS)是一慢性免疫炎症性疾病。多种危险因素(如ox-ldl)通过不同或相似的途径损伤血管内皮细胞，使后者细胞内胆固醇聚集，并触发细胞内信号瀑布，导致一系列促炎因子表达，促使树突状细胞、巨噬细胞、T细胞等各种免疫炎性细胞活化、迁移、粘附、聚集于内膜下，启动和促进血管局部的炎症反应［1，6］。胸腺间质淋巴细胞生成素(TSLP)是近年来发现的一种细胞因子，在人类其主要表达于上皮细胞和平滑肌细胞［7］，在心、肝、肺等脏器也见表达。研究发现，TSLP是树突状细胞最强烈的激活因子，在许多炎症性疾病的发病如哮喘、过敏性鼻炎、皮肤过敏、慢性阻塞性肺疾病、椎间盘突出症等的炎症反应中起“总开关”的作用，其主要生物学作用是通过State5和State3途径的激活，增加CD83、CD86、OX40L和MHCⅡ等因子的表达激活树突状细胞，促进 T细胞分化［3，8］。我们前期研究发现，受ox-LDL刺激的内皮细胞可明显表达胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)［4］，后者可以活化树突状细胞和巨噬细胞，促进T细胞分化。在本实验中我们进一步证实，受ox-LDL刺激后，HUVECs中TSLP的表达增多呈时间-剂量依赖性，这说明TSLP在AS发生发展相关的危险因素-血管内皮损伤-树突状细胞活化-炎性激活这一通道中可能起到重要的作用。

他汀类调脂药物可延缓和消退动脉粥样硬化病变，其机制主要是通过其调脂作用和一系列非调脂作用实现，起到改善血管内皮细胞功能，修复受损内皮，稳定动脉粥样硬化斑块，抑制炎症反应等作用［9］。他汀类药物能使内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)mRNA表达增加，同时可以增强eNOS的活性，从而使一氧化氮增多，对内皮起保护作用［10］。其他作者研究表明阿托伐他汀可抑制血管内皮细胞表达分泌多种炎性介质或细胞因子如组织蛋白、白介素6、白介素8及单核细胞趋化蛋白-1等，作用呈剂量依赖性［11，12］。我们前期研究发现，阿托伐他汀可降低冠心病患者循环C-反应蛋白(CRP)的水平，抑制树突状细胞的功能［2］，达到抗炎的作用。但这一作用是否通过抑制内皮细胞TSLP的表达介导尚不清楚。本实验中，我们通过将经ox-LDL刺激的内皮细胞与不同浓度的阿托伐他汀共培养，用多种方法检测发现，HUVECs培养上清中TSLP的浓度，细胞中TSLP mRNA表达及胞浆中TSLP的蛋白表达水平，都较对照组显著下降，其作用呈剂量依赖性。考虑到TSLP对树突状细胞的特异的活化作用，我们推测在体阿托伐他汀可能抑制内皮细胞TSLP的分泌，从而间接抑制树突状细胞的激活。不过本实验中，阿托伐他汀组未观察到TSLP的表达呈时间依赖性减少，分析其原因，可能是由于实验观测时间点的选择较少，未能显示出阿托伐他汀对TSLP抑制作用的作用时间曲线，这将在今后的机制研究中进行进一步的探讨。

本实验结果表明阿托伐他汀可抑制ox-LDL诱导的HUVECs TSLP的表达，这可能是阿托伐他汀抗炎，稳定动脉粥样斑块作用的原因之一。

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