DAPK1、ERα、HLA-Ⅰ基因蛋白表达水平与宫颈病变病理进程的相关性

古丽夏西·莫合衣提江 阿比达·阿布都卡德尔 阿布力孜·阿布杜拉 丁 岩

(新疆医科大学第一附属医院妇科，新疆 乌鲁木齐 830054)

宫颈癌主要致病原因包括高危型人乳头状瘤病毒(HPV)感染，但多数HPV感染者并未发展为宫颈癌，这说明尚有其他分子事件或遗传事件参与其发生。从分子生物学角度说，宫颈癌发生发展是个多基因参与的过程，从不同角度联合检测观察多个肿瘤相关基因变化及其引起的生物学特征改变，对于阐明和补充其发病机制及找到能反映宫颈病变严重程度的生物指标具有重大意义。本文从蛋白质水平观察死亡相关蛋白激酶(DAPK1)、人类白细胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ)、雌激素受体(ER)α基因与宫颈病变病理进程的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2006～2008年我院病理科存档的中老年汉族妇女子宫颈活检及手术切除的宫颈癌及宫颈病变患者石蜡标本115例，包括宫颈炎/CINⅠ41例，CINⅡ/Ⅲ49例，宫颈癌25例，标本由10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，标本采集前均未经任何放疗、化疗、免疫治疗，年龄24～60(平均42)岁。均经本院病理科有经验的副主任医师反复阅片后重新明确诊断。

1.2 主要试剂及仪器 主要试剂及仪器有 DAPK1、ERα、HLA-Ⅰ等特异性抗体(购于美国Santa Cruz公司);免疫组织化学SP方法试剂、酶标二抗(北京中杉金桥生物技术公司)，另有光学显微镜(BA210，Motic)。

1.3 免疫组织化学方法 采用免疫组织化学SP法。首先取石蜡包埋组织，制作成厚度为4 μm组织切片，然后脱蜡、水化和加热法(微波)抗原修复。再以H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，滴加稀释过的相应的DAPK1、ERα、HLA-Ⅰ等特异性抗体(一抗)，4℃过夜。第二天，滴加1∶2稀释的SP标记二抗(山羊抗兔，辣根过氧化物酶标记)，在37℃孵育1 h后依次加入DAB和苏木精显色，并常规脱水和透明封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组织化学结果判定 细胞膜或细胞质或细胞核内出现棕黄色颗粒判定为阳性。细胞染色百分率以以下标准判定:在显微镜下观察，记录各切片染色细胞百分比，染色细胞数＜5%为0分，5%≤染色细胞数≤25%1分，26%≤染色细胞数≤75%2分，染色细胞数＞75%3分。染色强度判定标准:不显色或显色不清0分，浅黄色1分，棕黄色2分，深棕色3分。综合积分按公式计算:综合积分=(染色细胞分数+染色强度分数)/2;综合判定:积分 ＜0.5分为“－”(缺失)，0.5分≤积分≤1.5分为“+”(不完全表达)，积分＞1.6分为“”(完全表达)。

1.5 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件进行χ2检验。

2 结果

2.1 DAPK-1蛋白表达与宫颈病变病理进程的关系 DAPK-1蛋白阳性表达主要分布在上皮细胞质，着色呈浅黄到棕黄色，DAPK-1蛋白阳性表达率在CINⅡ/Ⅲ和宫颈癌中明显降低，且DAPK1阳性表达率在宫颈癌组和CINⅡ/Ⅲ组中明显低于宫颈炎/CINⅠ组(P均＜0.05)，宫颈癌组DAPK-1阳性表达率低于CINⅡ/Ⅲ组，但差异不显著(P均＞0.05)。见表1，图1。

2.2 ERα蛋白表达与宫颈病变病理进程的关系 不同宫颈病变组织免疫组化染色结果显示ERα蛋白表达主要分布在细胞核、宫颈上皮细胞、几乎所有的宫颈间质细胞、炎细胞中。宫颈炎/CINⅠ组与CINⅡ/Ⅲ组和宫颈癌组比较两者之间差异显著(P均＜0.05)，但CINⅡ/Ⅲ组与宫颈鳞癌中阳性表达率比较，差异不显著(P＞0.05)。见表2，图2。

表1 不同宫颈病变中DAPK1表达情况〔n(%)〕

图1 DAPK1蛋白在不同宫颈病变组织中的表达(×400)

2.3 HLA-Ⅰ蛋白表达与宫颈癌及癌前病变相关性 HLA-Ⅰ蛋白阳性表达主要定位于上皮细胞膜上，细胞膜着色呈浅黄到棕褐色。CINⅡ/Ⅲ上皮内HLA-Ⅰ表达明显降低，宫颈癌内表达最低，不同病理级别宫颈病变中HLA-Ⅰ蛋白质表达水平差异显著(P均＜0.05)，在宫颈病变中HLA-Ⅰ基因蛋白质表达随着宫颈病变病理变化加重而递减。见表3，图3。

表2 不同宫颈病变中ERα的表达情况〔n(%)〕

图2 ERα蛋白在不同宫颈病变组织中的表达(×400)

表3 不同宫颈病变中HLA-Ⅰ表达情况〔n(%)〕

图3 HLA-1蛋白在不同宫颈病变组织内的表达(×400)

3 讨论

高危型HPV感染被认为是宫颈癌发生发展中必需的主要致病原因，但宫颈癌的发病机制尚不清楚。宫颈癌发生发展是多基因、多因素共同作用的复杂过程。癌基因的激活、抑癌基因的失活是导致肿瘤发生的最重要分子生物学基础。

DAPK是一种160 kU的钙调蛋白(CaM)调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是凋亡的正性调节因子，而凋亡与肿瘤发生、发展、转移密切相关〔1〕。DAPK1是已确认的抑癌基因，以往研究表明DAPK1基因在多种肿瘤细胞及肿瘤细胞系中失活，主要机制是由于异常的DNA甲基化修饰，从而使抑癌基因表达沉默，促使细胞恶性转化〔2，3〕。Yang 等〔4〕对 85 例宫颈癌手术样本及40例预处理的血浆样本采用甲基化特异聚合酶链反应(MSP)对于DAPK基因行甲基化分析检测，发现60%手术样本和40%血浆样本发生DAPK甲基化，异常甲基化宫颈癌组织及血浆中DAPK表达明显减少甚至缺失。本研究结果提示DAPK1缺失可能是CIN和宫颈癌发生发展的重要分子生物学基础。

宫颈癌发生、发展过程中免疫监视系统可能起重要作用。HLA系统是免疫系统中重要组成部分，肿瘤分子免疫学已证实了HLA-Ⅰ类分子在肿瘤免疫中处于重要的地位。1977年人类肿瘤细胞HLA分子缺失首次被发现，到目前为止人们已发现多种肿瘤细胞存在HLA分子缺失。研究证实HLA-Ⅰ类抗原在宫颈癌中常表达缺失，且部分HLA-Ⅰ类抗原表达缺失与5年生存率有显著关联〔5〕。本研究结果提示，可能由于HLA-Ⅰ蛋白在CINⅢ病变中表达明显减少，从而肿瘤得以发生、发展。HLA-1蛋白减少使得细胞毒性T细胞无法发挥其特异性杀伤靶细胞的作用，出现了免疫逃逸现象即HPV感染后所致的异型细胞及肿瘤细胞避开了免疫系统的监视作用导致了肿瘤发生发展。由此可见，HLA-Ⅰ抗原对于阻止CIN及宫颈癌的发生、发展及改善可能起重要作用。

ER是类固醇受体超家族中的一员，位于细胞核内，是雌激素调节的转录因子，分为ERα和ERβ两种亚型。ER在妇科肿瘤发生中可能起重要作用。ER及其功能途径受到多重调控，其通过自身磷酸化，或与不同生长因子、共调节因子、癌基因或抑癌基因蛋白结合或相互作用，从而调节靶细胞生长分化。Nonogaki等〔6〕发现ERα在宫颈正常组织中表达率较非典型增生及宫颈癌组织中高。研究报道〔7〕，无论是正常宫颈组织，还是CIN鳞状上皮和浸润性宫颈鳞癌组织ER表达情况不同，HPV感染型别亦不同。在ERα阴性宫颈组织中，HPV16、18型感染更多见;而ERα阳性宫颈组织，多为HPV31、33、35型等感染。这些研究结果说明ERα表达缺失可能是HPVl6/18致宫颈癌机制中不可缺少的环节。研究发现ERα过度甲基化与宫颈癌发病的关系，并认为ERα可能是抑癌基因，且与其他甲基化敏感基因联合检测，可大大提高肿瘤检出率〔8〕。ERα异常甲基化必然导致其转录水平变化，从而导致蛋白质表达降低或缺陷，但阐述宫颈病理进程与ERα基因表达水平变化关系文献并不多。本研究结果与以往文献报道一致〔9〕。ERα核表达下调或缺失可能是宫颈鳞癌发生的重要机制。ERα蛋白在宫颈病变组织中的表达水平在一定程度上对预测宫颈病变严重程度有帮助。

总之，DAPK1、HLA-Ⅰ、ERα等基因蛋白表达水平均随着宫颈病变病理变化的加重而降低，这些基因表达缺失可能是CIN及宫颈鳞癌的重要生物学特征，有望作为预测宫颈癌前病变及宫颈癌的早期预警指标，另外DAPK1、HLA-Ⅰ、ERα等基因蛋白表达也有可能成为宫颈癌基因治疗中有效的新的靶基因，本研究为宫颈癌前病变及宫颈癌基因甲基化等机制研究提供了重要基础和候选基因。

1 Anjum R，Roux PP，Ballif BA，et al.The tumor suppressor DAP kinase is a target of RSK-mediated survival signaling〔J〕.Curr Biol，2005;15(19):1762-7.

2 Levy D，Pluzbureau G，Decroix Y，et al.Death associated protein kinase loss of expression is a new marker for breast cancer prognosis clinical〔J〕.Cancer Res，2004;10(9):3124-30.

3 Kuester D，Dar AA，Moskaluk CC，et al.Early involvement of death-associated protein kinase promoter hypermethylation in the carcinogenesis of Barrett's esophageal adenocarcinoma and its association with clinical progression〔J〕.Neoplasia，2007;9(3):236-45.

4 Yang HJ，Liu VW，Wang Y，et al.Detection of hypermethylated genes in tumor and plasma of cervical cancer patients〔J〕.Gynecol Oncol，2004;93(2):435-40.

5 Mehta AM，Jordanova ES，Kenter GG，et al.Association of antigen processing machinery and HLA classⅠdefects with clinicopathological outcome in cervical carcinoma〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2008;57(2):197-206.

6 Nonogaki H，Fujii S，Konishi I，et al.Estrogen receptor localization in normal and neoplastic epithelium of the uterine cervix〔J〕.Cancer，1990;66(12):2620-7.

7 Shew ML，McGlennen R，Zaidi N，et al.Oestrogen receptor transcripts associated with cervical human papillomavirus infection〔J〕.Sex Transm Infect，2002;78(3):210-4.

8 Wisman GA，Nijhuis ER，Hoque MO，et al.Assessment of gene promoter hypermethylation for detection of cervical neoplasia〔J〕.Int J Cancer，2006;119:1908-14.

9 Fonseca-Moutinho JA，Cruz E，Carvalho L，et al.Estrogen receptor，progesterone receptor，and bcl-2 are markers with prognostic significance in CIN Ⅲ〔J〕.Int J Gynecol Cancer，2004;14(5):911-20.