大豆蛋白水解物促乳酸菌增殖发酵的研究

白凤翎，曲玲童，张柏林，赵宏飞

（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”辽宁省高校重大科技平台，辽宁锦州121013；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

大豆蛋白水解物促乳酸菌增殖发酵的研究

白凤翎1，曲玲童1，张柏林2，赵宏飞2

（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”辽宁省高校重大科技平台，辽宁锦州121013；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

应用小型生物发酵罐对乳酸菌增殖作用进行发酵研究，结果表明，12g/100mL脱脂乳中添加大豆蛋白水解物增殖复合剂对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长具有显著的促进作用。添加酵母膏脱脂乳培养基的产酸量比脱脂乳增加1倍，添加增殖复合剂后为脱脂乳的3.12倍。添加增殖复合剂可使乳酸菌数量达到10个数量级，比脱脂乳培养基提高1～2个数量级。从累积添加碱量和单位加碱量两项指标来看，脱脂乳培养基乳酸菌生长呈现缓慢上升曲线，添加酵母膏呈现三段波浪式曲线，添加增殖复合剂为陡峭的上升曲线。单纯添加酵母膏不能支持乳酸菌连续生长，添加大豆蛋白水解物和酵母膏能够使乳酸菌生长快速启动，并维持一个较高生长水平，获得较大的细胞量的同时也充分利用乳中蛋白质。

大豆蛋白水解物，乳酸菌，发酵，增殖

Abstract：The fermentation tests of proliferation on lactic acid bacteria（LAB） was carried out in bioreactor，the results showed that growth of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus were significantly promoted in 12g/100mL skim milk supplemented with soy protein hydrolysates（SPH）.The acid production of LAB on nonfat milk supplemented with yeast extracts and multiplication complex were 2 and 3.12 times than that of control.Then the cell count of LAB reached to 10lg cycle on skim milk supplemented with multiplication complex，which increased 1.0～2.0lg cycle than control.The parameter of accumulate additional alkali volume and interval additional alkali volume showed that the growth curve of LAB on skim milk ascend slowly，and three waves trend as supplemented with yeast extract，and went up dramatically with addition of multiplication complex.The addition of yeast extract alone can not support the continual growth of LAB，however，the addition of yeast extract and protein hydrolytes together can accelerate it and made it to keep in a high growth level.Much more biomass of LAB on milk with multiplication complex would be obtained and the protein in milk would be utilized sufficiently.

Key words：soy protein hydrolysates；lactic acid bacteria；fermentation；proliferation

直投式（direct-vat-set，DVS）酸奶发酵剂具有无需中间继代培养，使用方便快捷，产品质量稳定等特点，在发酵乳制品中广泛应用，作为一类新型的商品化制剂，细胞数量是影响乳酸菌发酵性能的关键因素。乳是乳酸菌的天然栖息地和生长的良好培养基，其中短肽是乳酸菌生长的主要氮源[1]。由于乳酸菌具有很弱的蛋白水解能力，乳中酪蛋白形成短肽和氨基酸不能完全满足乳酸菌高密度生长的需要[2]，因此，以乳为基质制备直投式发酵剂一直受到细胞密度制约。利用蛋白水解物作为乳酸菌生长增殖剂添加到乳中，提高培养基中多肽和氨基酸含量，使乳酸菌在生长过程中缩短延迟期，延长对数期和稳定期，大幅度提高细胞数量，从而通过廉价蛋白水解物促进乳酸菌增殖，降低生产成本，提高经济效益。本文在实验室条件下应用小型生物发酵罐，研究大豆蛋白水解物增殖复合剂对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌生长的影响，探究大豆蛋白水解物对乳酸菌的增殖作用效果，为建立乳酸菌高密度细胞培养体系提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）S1菌株、德式乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus bulgaricus）L2菌株 北京林业大学食品发酵实验室保存菌种。

12g/100mL脱脂乳培养基 临用前配制，倒入发酵罐中，连同发酵罐115℃灭菌20min；大豆分离蛋白 含量为91.6%，山东禹王实业有限公司；6mol/L NH4OH 临用前配制，115℃灭菌20min；酵母膏。

BIOTECH-3BG-5BG生物发酵罐 上海保兴生物设备有限公司。发酵罐以底盘加热和循环水控制温度，温度控制在设定温度±0.2℃，pH控制在设定pH±0.05，转速控制在设定转速±1r/min范围内。主要技术指标：玻璃罐体，3、5L；磁力搅拌速度，50～1000r/min；温度控制，（冷却水＋5～65℃）；消毒方式，整体灭菌锅消毒。计算机全程监控温度、pH、溶解氧（DO）、转速、空气流量、罐内压力等各项指标，全程记录加碱、加酸、消泡和补料等情况。

1.2 实验方法

S1菌株和L2菌株分别经12g/100mL脱脂乳37℃培养后，在MRS琼脂上分离，取单个典型菌落经12g/100mL脱脂乳传代3次，充分恢复菌株活力用作发酵实验菌种。

大豆蛋白水解物是以5%大豆分离蛋白为基质，经90℃水浴中预热15min，冷却，调节pH至8.0。按4000U/g加入碱性蛋白酶，50℃水浴作用6h。在反应过程中，滴加2.0mol/L NaOH维持pH稳定。反应结束后85℃加热10min钝化酶，离心取上清液[3]。经Millipore Lab scale TFF System Kit超滤获得小于5ku分子量的大豆蛋白水解物，经测定其中多肽和氨基酸含量为3.02g/100mL。乳酸菌增殖复合剂为大豆蛋白水解物与酵母浸出物两者按5∶1质量比例临用时混匀配制而成。

应用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合菌株分别在12g/100mL脱脂乳培养基、12g/100mL脱脂乳培养基添加0.5%酵母膏和12g/100mL脱脂乳培养基添加增殖复合剂三种条件下进行混合发酵的实验研究。

1.2.1 温度控制 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌联合生长具有典型生理学特征，相对而言，嗜热链球菌比保加利亚乳杆菌具有较强的蛋白水解能力。在两者混合生长过程中，早期嗜热链球菌生长占优势地位，随着乳酸的形成保加利亚乳杆菌逐渐取代嗜热链球菌为优势菌种，二者共同培养的最佳生长温度为略高于40℃，温度过高过低都会影响细菌的数量和发酵活力[4]。本实验将温度控制在（42±0.5）℃范围内。

1.2.2 pH控制 乳酸菌发酵乳中糖类形成乳酸pH从6.5左右逐渐下降到4.0左右，酸性环境对乳酸菌生长、生存产生不利的影响。在乳酸菌发酵剂生产过程中，控制培养基的pH是获得高密度、高活性的细胞的一种有效手段。吴荣荣[5]研究表明，将发酵乳的pH维持在5.90左右获得乳酸菌细胞量最大，考虑生产发酵剂时培养基中存在较多的金属离子可能对乳酸菌产生不利的影响，选用6mol/L NH4OH作为中和性试剂控制培养基的pH在5.90±0.05范围内。

1.2.3 转速控制 工厂化生产发酵剂采用大型发酵罐，采用静止培养方式不能有效传递物质和热能，会形成物质梯度和温度梯度，特别在pH调控时会产生酸度差异性。相反，搅拌会影响凝乳过程、抑制乳酸形成[6]，同时搅拌可使部分空气进入培养基基质中，形成微好氧环境，更有利于乳酸菌的生长[7]。搅拌速度过低达不到物质和热传递要求，过高使空气进入过多会影响乳酸菌生长，一般选择在100r/min比较适宜[8]。本实验选择转速为85r/min，在细菌进入对数生长期后，随着产酸量增加，滴加6mol/L NH4OH的量不断加大，适当增加转速至100r/min，然后回至85r/min。

灭菌前准确校正发酵罐pH电极，灭菌后取少量培养基用酸度计测定pH，两者比较，确定pH的变化情况，调节pH。在接种口以酒精火焰下分别接种2.5%嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵乳培养物，设定温度为42℃、pH为5.90、转速为85r/min开始发酵实验。

1.2.4 乳酸菌发酵动力学分析

1.2.4.1 发酵过程中乳酸菌产酸量变化分析 依据不同发酵阶段的碱消耗量计算发酵过程中产酸量，由累积和单位时间（0.1h）滴加碱量间接推断细菌生长量及生长速率。

式中：μX-比生长速率；dX-单位时间加碱量；dT-单位时间。

1.2.4.2 发酵过程中乳酸菌数量分析 分别在0、2、4、6、8h取发酵样品，每个样品做三个平行实验按参考文献[9]进行乳酸菌活菌计数。

1.2.5 实验数据处理 实验数据采用Excel 2003进行处理分析。

2 结果与讨论

2.1 发酵过程中乳酸菌产酸变化

乳酸菌发酵产酸的过程间接反映了细菌生长过程，图1反映了12g/100mL脱脂乳培养基乳酸菌生长过程中补加6mol/L NH4OH的变化情况。柱状图表示整个过程累积加碱的总量变化，折线图表示每0.1h单位时间加碱的变化情况，整个发酵过程共8h，大多数时间里，单位时间滴加碱量在1mL以下，总消耗NH4OH为53.598mL。从柱状图来看，发酵0.71h开始滴加碱液，一直到发酵结束产酸总量呈缓慢的趋势上升，说明细胞产酸（生长）维持一个相对稳定的水平。图1中单位时间滴加碱量反映产酸的量，可将折线图看作是比生长速率μX，间接指示乳酸菌的比生长速率。从折线图的变化来看，开始到0.71h为0mL/0.1h，说明细菌的数量几乎没有增加，细菌生长处于一个延迟阶段。随后呈现一个急速的上升阶段，在1.10h时达到最大值为2.169mL/0.1h，表明细菌生长进入对数期，从1.10～3.60h加碱量维持在1.0mL/0.1h水平上下波动，说明此阶段处于对数生长期，细菌生长旺盛。从3.61～4.81h滴加碱量有所下降但很能维持在相对较高的水平，平均为0.70mL/0.1h，表明细菌生长处于稳定期。从4.91h至发酵结束加碱量在0.5mL/0.1h以下，反映细菌生长呈现下降趋势。

图1 乳酸菌在12g/100mL脱脂乳培养基中生长滴加碱量变化Fig.1 Cumulative volume of dropping NH4OH LAB growing in 12g/100mL skim milk

图2 乳酸菌在添加增殖复合剂12g/100mL脱脂乳培养基中生长滴加碱量变化Fig.2 Cumulative volume of dropping NH4OH of LAB growing in 12g/100mL skim milk adjunct SPH complex

图2为12g/100mL脱脂乳培养基中添加大豆蛋白水解物增殖复合剂的乳酸菌发酵过程加碱量变化情况，与12g/100mL脱脂乳对照培养基相比，可以看出几点明显差异：a.总加碱量为167.329mL，是脱脂乳的3.12倍，相应的细胞数量大幅度增加，说明添加增殖复合剂的效果极其显著；b.从柱状图来看，1.00～5.20h产酸量沿着一个很陡的上升趋势增加，说明这阶段是细菌的快速生长期即对数期，5.30h到发酵结束产酸量变化趋缓，稳定在一定的生长水平，维持在稳定期；c.从折线图滴加碱量变化来看，0～0.90h为延迟期；1.00～3.50h单位时间加碱量呈直线上升阶段，为对数生长期，3.50～3.60h达到最大值5.348mL/0.1h；随后呈下降趋势，到5.20h仍维持在4.0mL以上，说明该阶段细菌生长由对数期向稳定期过渡；从5.30h开始进入一个明显的下降通道，滴加碱量维持在2.0mL/0.1h以下，细菌生长处于一个稳定阶段，结合柱状图说明细胞数量逐渐增加，然后趋于稳定。

图3 乳酸菌在添加酵母膏12g/100mL脱脂乳培养基中生长滴加碱量变化Fig.3 Cumulative volume of dropping NH4OH LAB growing in 12g/100mL skim milk adjunct yeast extract

在12g/100mL脱脂乳培养基中添加0.5%酵母膏乳酸菌发酵滴加碱量变化如图3所示，从柱状图可以看出累积加碱量三级台阶式，而折线图呈现的波浪式的三个阶段。8h发酵总消耗碱量为110.196mL，为脱脂乳发酵的2倍，为添加增殖复合剂的三分之二。单位时间最大加碱量为2.294mL，是脱脂乳发酵平均数值的2倍多，却只有添加增殖复合剂的二分之一。

第一次快速产酸阶段是0.61～1.91h，产酸累积量为15.26mL。此阶段的单位时间产酸量开始快速上升，然后迅速消落，维持在1.0～2.0mL/0.1h之间。此阶段可能是由于培养基中添加了酵母膏，为培养基补充一定量的游离氨基酸和短肽，使细菌处于一个快速生长过程，但因为氮源数量有限使细菌生长速度暂时回落。第二个快速产酸阶段为2.01～5.21h，产酸累积为43.47mL。此阶段的前半阶段2.01～3.01h加碱量在1.0mL以下是一个准备阶段，然后进入迅速上升阶段（3.11～4.31h）。滴加碱量从1.0mL升到2.294mL，此阶段细菌生长快速，获得较大细胞量，随后又呈下降趋势（4.41～5.21h）。乳酸菌经过第一阶段后，虽然生长速度暂时放缓，但细菌数量已经达到较高的水平，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌二者协同生长后，具有较强的分解酪蛋白的能力。从图的变化来看，表明在培养基中已经具有一定量的短肽和氨基酸，与酵母膏一同推动细菌的快速生长。第三个阶段为5.31～8.01h，由于产酸累积量维持一个缓慢的上升趋势，经过一个小幅上升后很快回落到一个稳定的水平，表明细菌生长趋于稳定后期。

2.2 发酵过程中乳酸菌数量变化

在小型发酵实验过程中，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合生长细胞数量变化如图4所示，三种培养基中乳酸菌生长从2h到6h处于上升的通道中，6h后下降，几乎与单位时间滴定碱量变化同步。乳酸菌数量由最初的106cfu/mL分别升高至109和1010数量级。三种培养基乳酸菌生长的柱状图表明，6h后12g/100mL脱脂乳培养基乳酸菌生长细胞数量最低，添加酵母膏的细胞数量比12g/100mL脱脂乳提高1个数量级，p＜0.05，增殖效果显著；添加增殖复合剂的细胞数量比12g/100mL脱脂乳提高近2个数量级，p＜0.01，增殖效果极显著。发酵实验结果表明大豆蛋白水解物增殖复合剂对乳酸菌生长具有显著的促进作用。

图4 在发酵罐三种培养基中乳酸菌生长细菌数比较Fig.4 Comparison on growth of Lb.and St.in three media fermenting in bioreactor

3 结论

在乳培养基中添加大豆蛋白水解物进行乳酸菌发酵研究，从累积流加6mol/L NH4OH总量反映的产酸量指标来看，添加酵母膏比12g/100mL脱脂乳增加1倍，添加增殖复合剂比12g/100mL脱脂乳增加2.12倍，说明大豆蛋白水解物增殖复合剂对乳酸菌生长具有非常显著的促进作用。从单位时间滴加碱量指标反映乳酸菌的生长过程来看，12g/100mL脱脂乳中乳酸菌生长呈现一个缓慢的上升趋势，为一个典型的细菌生长曲线；添加酵母膏后呈现三阶段波浪式曲线，可能与培养基中氨基酸和小肽的含量变化相关；添加增殖复合剂后表现为比较陡峭的上升曲线，然后缓慢回落到一个稳定的水平，表明大豆蛋白水解物后比添加酵母膏更能够使乳酸菌生长维持一个较高水平。从乳酸菌数量的变化来看，发酵6h是最佳收获期，添加增殖复合剂可使乳酸菌数量达到10个数量级，与单独使用脱脂乳和添加酵母膏相比，细菌数量可提高1.0～2.0个数量级，增殖效果显著。

乳是生产乳酸菌直投式发酵剂的廉价培养基，但由于乳酸菌本身不能合成各种氨基酸和维生素，乳培养基不能满足乳酸菌高密度生长的需要。在大规模培养乳酸菌时，在培养基中添加一些富含有短肽、氨基酸和维生素等生长因子的廉价蛋白水解物是促进乳酸菌增殖，获得高密度乳酸菌活性细胞的有效方法。应用小型生物发酵罐对乳酸菌发酵实验研究，在脱脂乳培养基中，添加含有大豆蛋白水解物的复合增殖剂对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合生长具有明显的促进作用，对乳酸菌直投式发酵剂生产具有非常重要的应用价值。

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Study on soy protein promoting proliferation fermention of lactic acid bacteria

BAI Feng-ling1，QU Ling-tong1，ZHANG Bo-lin2，ZHAO Hong-fei2
（1.College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，Engineering and Technology Research Center of Food Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou，Liaoning 121013，China；2.College of Biological Science and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0209-04

2012-01-13

白凤翎（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术与食品安全。

国家863计划（2006AA10Z344）；国家863计划（2008AA10Z335）；辽宁省高校重大科技平台开放课题（LNSAKF2011011）。