玉米ACE抑制肽水解酶的筛选及酶解条件的优化

宋 亮，曹龙奎，，*，刁静静，佟万兵，刘洪儒

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；2.黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江大庆163319）

玉米ACE抑制肽水解酶的筛选及酶解条件的优化

宋 亮1，曹龙奎1，2，*，刁静静2，佟万兵1，刘洪儒1

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；2.黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江大庆163319）

酶解玉米蛋白粉（蛋白含量为70%）制备血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，通过酶的筛选实验确定了AS.1398中性蛋白酶作为最佳水解酶，在此基础上，进行pH、温度、底物浓度、加酶量[E]∶[S]的单因素实验，并且确定4种因素的参数值进行L9（34）正交实验，采用体外检测ACE抑制率和肽得率为指标来确定最佳工艺条件。研究结果表明，选用AS.1398中性蛋白酶作为水解酶，水解时间在2h时，pH7.0，温度50℃，底物浓度5%，加酶量[E]∶[S]为1.5∶100，得到的最大ACE抑制率为85.65%，肽得率为58.64%。

玉米蛋白，ACE抑制肽，ACE抑制率，肽得率

Abstract：Enzymatic hydrolysis of corn protein powder（protein content 70%） to produce ACE inhibitory peptides，by the enzymatic screening test to determine the AS.1398 neutral protease enzyme as the best，on this basis，used the pH，temperature，substrate concentration，the amount of enzyme[E]∶[S]in the single-factor test and determined the four factors in L9（34） orthogonal test，through vitro study to detect ACE inhibition rate and yield of peptide as indicators to determine the optimum technology conditions.The result indicated that AS.1398 neutral protease was the best hydrolytic enzyme，when the hydrolysis time in 2h，pH7.0，temperature 50℃，5%substrate concentration，the amount of enzyme[E]∶[S]1.5∶100，and the maximum ACE inhibition rate was 85.65%，the yield of peptide was 58.64%.

Key words：corn protein；ACE inhibitory peptides；ACE inhibition rate；yield of peptide

高血压是影响人类健康最常见的慢性非传染性疾病，主要通过肾素-血管紧张素系统（RAS）调节。在RAS系统中，肾素血管紧张素转换为血管紧张素I（AT-I），然后通过ACE转换为血管紧张素II（AT-II），从而导致了不良的血管收缩率而发生高血压；另外ACE也可以使得舒缓基肽失活，进而失去使血管壁收缩的能力，使血压升高。目前使用化学合成药物如：卡托普利，阿拉普利等治疗高血压，然而，这些药物会产生一些不良反应，例如：咳嗽，味觉紊乱和皮疹；因此它们治疗高血压的应用得到了限制。虽然天然的ACE抑制肽降压效果不如体外药物效果好，但是具有无毒副作用和低医疗成本的优点，而且，这些肽有多种功能特性，很容易被人体吸收并且具有较高的营养价值，有助于人体健康，具有广阔的应用前景[1-3]。我国对降血压肽的研究起步较晚，但报道渐多，前景看好。于胜男[4]等利用碱性蛋白酶酶解大豆蛋白，在6h左右达到最大抑制率68.54%；辛志宏[5]等则从酶解小麦胚芽蛋白中分离纯化得到Val-Trp和Ala-Met-Tyr两种降血压肽；王婷[6]等酶解葵花籽粕蛋白并确定了最佳参数组合，得到产品IC50值为6.06mg/mL。而在国外，Suh等[7]从玉米黄粉中分离出序列为Pro-Ser-Gln-Tyr-Tyr的一种膜结合蛋白肽，IC50为100μmol/L；S Yano[8]等在此基础上又分离出30余种玉米短肽，具有较低的IC50值。S Miyoshi等[9]报道了玉米醇溶蛋白酶解得到的Leu-Pro-Pro是迄今发现的蛋白水解得到最好的ACE抑制肽。蛋白质序列中具有ACE抑制活性的区域可通过酶解的方法释放出来，也就是说人们可以从食品蛋白质中通过酶降解的方法获得降血压肽，这将成为研究开发治疗高血压药物的又一新途径[10]。本实验以蛋白含量为70%的玉米蛋白粉为原料，通过进行酶的筛选实验得出最佳水解用酶，经单因素实验筛选出性能较好的制备玉米ACE抑制肽的水解酶并确定其最优的水解时间，以水解温度、水解pH、加酶量[E]∶[S]、底物浓度为单因素，选出适合正交实验的参数范围，进行正交实验和方差分析，选出最优组合，为工业化生产提供可行性的工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米蛋白粉（蛋白含量70%） 黑龙江昊天玉米开发有限公司；Alcalase 2.4L碱性蛋白酶（酶活力为1.2×105U/g）、AS.1398中性蛋白酶（酶活力为2.0×105U/g）、风味蛋白酶Flavourzyme（酶活力为1.5×105U/g）、胰蛋白酶（酶活力为2.5×105U/g） 丹麦诺维信公司；马尿酰组氨酸亮氨酸Hip-His-Leu（HHL） ACE sigma公司；其他试剂 均为国产分析纯。

LNK—871型凯式定氮仪 江苏省宜兴市科教仪器研究所；AR2140型电子分析天平、Delta-320型pH计 上海梅特勒—托利多仪器有限公司；DK-S24型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器 常州国华电器有限公司；TGL-16B型台式离心机 上海安亭科学仪器厂制造；T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；B-191型喷雾干燥器 BUCHI SWITERLAND。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质含量的测定 采用凯式定氮法。

1.2.2 玉米蛋白粉的预处理 将原料玉米蛋白粉经粉碎机粉碎后过100目筛，收集过筛后的淡黄色粉末，再95%乙醇作为浸提剂去掉玉米黄色素，得到酶解底物[11]。

酶解底物在水解前应进行预热处理，将玉米蛋白粉溶解于蒸馏水中，在100℃下煮沸5～10min，目的是打破蛋白分子内部的结构，使蛋白酶的作用位点增加，不仅提高酶解速度，还能增加水解液中肽含量，增加肽水解得率，使其尽可能的水解完全。所以，水解前进行短时间高温预处理对整个水解过程是必要的[12]。

1.2.3 ACE抑制多肽的制备 称取一定量处理过的玉米蛋白粉，加蒸馏水溶解，100℃加热10min，降至酶的最适温度，使pH达到酶作用的最适范围，加入一定量酶，启动反应。水解过程中，滴加1mol/L的NaOH使pH保持在酶作用的最适pH，水解一定时间后，结束反应，加热煮沸灭酶，以4000r/min离心20min后即得到上清液[13]；之后经过喷雾干燥得到粉末状ACE抑制多肽。

1.2.4 肽得率的测定 采用半微量凯式定氮法测定肽得率。将水解液于4000r/min离心20min，澄清玉米肽液，收集上清液。准确称取沉淀质量，并用其中蛋白质含量，计算玉米肽得率[14]。

肽得率（%）=[1-（沉淀物中的蛋白质含量×沉淀物质量）/水解蛋白质总质量]×100

1.2.5 ACE抑制活性检测[15]本实验采取体外检测法，取100μL HHL（5mmol/L）和40μL玉米ACE抑制剂（浓度5%）混合于37℃下保温3min后，加入ACE（活力单位0.33U/mL）10μL，混匀后于37℃下保温30min，再加入250μL的1mol/L HCl，终止反应，再加入1.7mL的乙酸乙酯经15s振荡后，以10000r/min离心10min，吸取1.0mL的乙酸乙酯层，放入85℃烘箱干燥1h，加入3mL去离子水，混匀后于228nm下测定吸光值。对照组除了不加抑制剂，空白组除在反应前后加入0.2mL 1mol/L HCl外，其余操作与反应管相同。

ACE抑制率（%）=（ODa-ODb）/（ODa-ODc）×100

式中，ODa为对照组；ODb为样品组；ODc为空白组。

1.2.6 酶解单因素实验 酶解单因素实验的基本条件：pH7.0，底物浓度5%，加酶量[E]∶[S]为1∶100，温度50℃，改变其中一个条件，固定其他条件以分别考察pH、底物浓度、加酶量、温度对ACE抑制率和肽得率的影响。各因素水平梯度分别为：pH：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；底物浓度：3%、5%、7%、9%、11%；加酶量[E]∶[S]：0.5∶100、1∶100、1.5∶100、2∶100、2.5∶100；温度：40、45、50、55、60℃。

1.2.7 酶解正交实验及方差分析 通过对酶的筛选及单因素实验的结果进行分析，选择影响ACE抑制率最大的几个因素进行正交实验，正交实验水平设计如表1，选择最优参数组合，并且进一步进行验证实验。

表1 正交实验设计因素水平表Table 1 The levels and factors of orthogonal experiment design

1.2.8 数据分析 所得数据均为3次重复的平均值，原始数据的整理及作图采用Microsoft Excel（Office2003）软件完成；数据处理采用正交助手软件。

2 结果与分析

2.1 不同酶对ACE抑制率和肽得率的影响

蛋白酶是水解肽键的专一酶类，其来源丰富，种类繁多，各种蛋白酶对肽键的作用方式和作用位点有很大区别，所以生成的肽段结构和数量也不一样，因而产生了不同的抑制作用，如表2所示。

根据贾俊强等[16]对降血压肽结构的分析，与降血压肽活性密切相关的是C端氨基酸性质。因此，在选酶时，主要考虑蛋白被水解后水解产物C端的氨基酸性质，当Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu出现在小肽的C端时，该肽可能具有极强的降血压活性。因此，选酶时应首先选择酶切位点在Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu的疏水性蛋白酶。虽然原料玉米蛋白粉中的疏水性氨基酸含量较高，但是碱性蛋白酶、风味蛋白酶作用位点广谱，酶解出来的肽含量比较多，有降血压功效的肽就比较少，胰蛋白酶作用位点在Lys和Arg之后，酶解出的肽降压效果就更小；而AS.1398中性蛋白酶的作用位点在Leu和其他氨基酸残基，而原料玉米蛋白粉中亮氨酸（Leu）含量为16.3%，远远高于其他氨基酸含量，所以从酶的专一性和降压肽结构特点来说，采用AS.1398中性蛋白酶酶解出的肽的降血压效果比其他蛋白酶酶解出的肽的降压效果要好。

表2 蛋白酶及水解特性Table 2 The hydrolysis characteristics of different proteases

图1 不同蛋白酶对ACE抑制率的影响Fig.1 Effect of different protease on ACE inhibition

图2 不同蛋白酶对肽得率的影响Fig.2 Effect of different protease on the yield of peptide

图1、图2为水解时间在1、2、3、4、5h内的AS.1398中性蛋白酶、Alcalase 2.4L碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶的筛选情况，其他因素为底物浓度5%，pH7.0，[E]∶[S]为1∶100，温度为50℃，每个小时取样并进行ACE抑制率和肽得率的测定进行水解，将每小时取样离心后的上清液经过喷雾干燥得到粉末状ACE抑制多肽，之后均以5%浓度溶于水中测定其ACE抑制率和肽得率。从图1中看出AS.1398中性蛋白酶在2h达到了最大ACE抑制率84%（3次重复实验结果差异较小），Alcalase 2.4L碱性蛋白酶和胰蛋白酶的ACE抑制率都偏低，风味蛋白酶在1h ACE抑制率虽达到78.7%，但1h后ACE抑制率逐渐下降，到5h时，其抑制率下降到30%；在图2中可以看出，4种蛋白酶的肽得率都随着时间的增加而增加并且呈线性，Alcalase 2.4L碱性蛋白酶和AS.1398中性蛋白酶在5h的肽得率分别为62.05%和61.37%，均高于胰蛋白酶和风味蛋白酶，可能是由于Alcalase 2.4L碱性蛋白酶和AS.1398中性蛋白酶的作用位点在底物蛋白质中的含量较多，所以肽得率就高，但是Alcalase 2.4L碱性蛋白酶的ACE抑制率与AS.1398中性蛋白酶的酶解产物相比较低。

所以在相同的蛋白水解物（浓度为5%）的条件下，AS.1398中性蛋白酶的ACE抑制率和肽得率均较高并且在2h时ACE抑制率达到了的84%，比其他三种蛋白酶在相同蛋白水解物浓度下的ACE抑制率和肽得率较高，蛋白酶的筛选和最适水解时间为下一步单因素和正交实验的重要参数；这与何慧等[17]的玉米大豆复配蛋白制备降血压肽水解酶筛选研究基本一致。Mullally[18]的研究也表明，ACE的抑制率在反应初期是随着反应时间和肽得率的增加而增加的，但反应达到一定程度的时候，ACE的抑制率反而会随时间和肽得率的增加而降低。这有可能是酶解物随着酶解时间的延长，对具有ACE活性的基团产生影响，从而导致ACE抑制率下降。

综上，从酶的专一性，降压肽结构特点和实际酶解实验来说，采用AS.1398中性蛋白酶为最佳用酶。

2.2 不同pH对玉米ACE抑制肽ACE抑制率和肽得率的影响

图3 不同pH对ACE抑制率和肽得率的影响Fig.3 Effect of different pH on the rate of yield of peptide and ACE inhibitory

图3为pH在5.0～9.0的范围体系下玉米ACE抑制肽的ACE抑制能力和肽得率，其他因素为底物浓度5%，[E]∶[S]1∶100，温度50℃，水解时间2h进行水解，水解结束后，取不同pH的水解上清液进行喷雾干燥，之后均配成5%溶液测定ACE抑制率和肽得率，每个实验水平进行三次重复实验。从图3中可以看出随着pH的增加，其ACE抑制率和肽得率不同程度的增加，当pH8.0～9.0时ACE抑制率和肽得率趋于平缓，并且肽得率下降的幅度更大一些，可见AS.1398中性蛋白酶在中性环境更适合些，所以选择pH6.0～8.0为下一步正交实验的三个水平。

2.3 不同底物浓度对玉米ACE抑制肽ACE抑制率和肽得率的影响

图4 不同底物浓度对ACE抑制率和肽得率的影响Fig.4 Effect of different substrate concentration on the rate of yield of peptide and ACE inhibitory

图4为3%、5%、7%、9%、11%底物浓度下的水解产物的肽得率与ACE活性抑制能力。其他因素为pH7.0，[E]∶[S]1∶100，温度50℃，取不同底物浓度的水解上清液进行喷雾干燥，之后均配成5%溶液测定ACE抑制率和肽得率，结果均为3次重复平均值。从图4中可以看出5%、7%、9%、11%底物浓度的玉米蛋白肽在2h时水解产物的ACE抑制率都有增加的趋势，但当底物浓度增加到11%时，由于底物浓度过高，加热变性使底物黏度过大，从而使反应难以进行[19]，可能是由于体系底物浓度过大会造成体系中的有效水分浓度过低，因此降低了底物和蛋白酶的扩散和运动，从而对水解产生抑制作用[20]。所以，ACE抑制率没有变化，肽得率有所下降，故选择底物浓度为5%、7%、9%作为因素水平。

2.4 不同[E]∶[S]对玉米ACE抑制肽ACE抑制率和肽得率的影响

图5 不同[E]∶[S]对ACE抑制率和肽得率的影响Fig.5 Effect of different[E]∶[S]on the rate of yield of peptide and ACE inhibitory

图5为不同[E]∶[S]下的水解产物的肽得率与ACE活性抑制能力，[E]∶[S]分别为0.5∶100、1∶100、1.5∶100、2∶100、2.5∶100，其他因素为底物浓度5%，pH7.0，温度50℃，水解时间2h，取不同[E]∶[S]的水解上清液进行喷雾干燥，之后均配成5%溶液测定ACE抑制率和肽得率，3次重复实验的结果差异性不大。由图5可以看出，随着[E]∶[S]的增加，肽得率和ACE抑制率的总趋势逐渐增加，当底物浓度一定、[E]∶[S]未达到饱和时，酶的加入量提高，酶的位点大大增加，有利于酶与底物的结合，促进酶解，使得大部分大分子蛋白在较短时间内被降解成为小分子肽，使肽得率增大；并且随着加酶量的增加，ACE抑制率也随着增加，但酶加入量过大，一是增加成本，二是不利于后续酶解液的精制。综合考虑，以[E]∶[S]为1∶100、1.5∶100、2∶100最为合适。

2.5 不同温度对玉米ACE抑制肽ACE抑制率和肽得率的影响

图6 不同温度对ACE抑制率和肽得率的影响Fig.6 Effect of different temperature on the rate of yield of peptide and ACE inhibitory

如图6所示，在相同的其他因素条件下，取不同水解温度的上清液进行喷雾干燥，得到的粉末状均配成5%溶液测定ACE抑制率和肽得率，3次重复实验的结果差异性不大。当温度从40℃升至50℃时，ACE抑制率和肽得率有明显的增加，但50℃以后下降较快，这可能由于在一定范围内温度上升有利于酶促反应的进行，但温度过高，会导致酶蛋白变性，从而使酶活性减弱，主要因为酶分子吸收了过多的能量，引起了维持酶分子结构的次级键解体，导致酶蛋白变性，从而使酶活性减弱或丧失[21]。所以因素水平选择40、45、50℃。

2.6 玉米ACE抑制肽制备工艺的正交实验结果与分析正交实验

经过筛酶实验，本工艺采用AS.1398中性蛋白酶进行酶解实验，选择pH、底物浓度、[E]∶[S]加酶量、温度4个因素设计L9（34）正交实验，以酶解产物的肽得率和ACE抑制率为指标共同考察酶解效果。在筛选酶的实验中，AS.1398中性蛋白酶在2h时达到了最大ACE抑制率，所以，正交实验选择的酶解时间为2h。

如表3、表4所示，从肽得率的指标考虑，通过直观分析中极差结果发现，4个酶解因素对肽得率的影响从大到小依次为：C＞D＞B＞A，即：[E]∶[S]＞温度＞底物浓度＞pH，最优组合为A2B1C2D3，但是k值检验后的最优组合为A2B2C2D3，没有出现在9个实验组中，但是进行比较对比这2个组合，只是差在底物浓度的选择上，而底物浓度对肽得率指标的影响较小，因此认为2个方案基本一致，并且如果底物浓度较大的话，会使后期的实验很难进行。除此之外，通过三次的重复实验进一步验证得到的实验组中的最优组合A2B1C2D3（59.58%）大于组合为A2B2C2D3（57.5%），所以确定A2B1C2D3为肽得率的最优组合。采用F检验对各因素进行方差分析（α=0.05）可以看出，[E]∶[S]对肽得率有显著的影响，pH和底物浓度对其影响较小，并且方差分析的结果与极差分析的结果一致。

表3 正交实验设计与结果Table 3 Design and results of orthogonal experimental

表4 肽得率方差分析表（Fα=0.05）Table 4 Yield of peptide analysis of variance table（Fα=0.05）

表5 ACE抑制率方差分析表（Fα=0.05）Table 5 ACE inhibition analysis of variance table（Fα=0.05）

如表3、表5所示，从ACE抑制率的指标考虑，通过直观分析中极差结果发现，对ACE抑制率的影响从大到小依次为：C＞D＞B＞A，即：[E]∶[S]＞温度＞底物浓度＞pH，最优组合为A2B1C2D3，但是经k值检验后的最优组合为A3B1C2D3，没有出现在9个实验组中，但是进行比较对比分析2个组合，发现只是在pH的选择上有差异，但是pH是4种因素中影响最小的，并且AS.1398中性蛋白酶适合在中性的条件下进行反应，所以选择A2（pH7.0）为最佳，同时通过三次的重复实验得到的最优组合A2B1C2D3（88.25%）大于组合为A3B1C2D3（82.77%），所以确定A2B1C2D3为最优组合。通过F检验对各因素进行方差分析（α=0.05）可以看出，[E]∶[S]对ACE抑制率有显著的影响，温度和底物浓度对ACE抑制率影响不大，pH对ACE抑制率影响最小，并且方差分析的结果与极差分析的结果一致。

比较肽得率和ACE抑制率这2个指标得到相同最佳方案A2B1C2D3，即pH7.0，底物浓度5%，[E]∶[S]为1.5∶100，温度50℃。为了进一步验证最佳方案的可行性，在A2B1C2D3的条件下进行酶解实验，重复3次，测得的肽得率平均值为58.64%，ACE抑制率平均值为85.65%，与实验结果差异不大。

3 结论

酶种类是酶解过程中最重要的影响因素，用不同蛋白酶酶解玉米蛋白均可以获得具有血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性的酶解产物，但不同酶所产生的酶解产物的ACE抑制率和肽得率相差较大。一方面，在选酶时，主要考虑蛋白被水解后水解产物C端的氨基酸性质，当Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu出现在小肽的C端时，该肽可能具有极强的降血压活性。因此，选酶时应首先选择酶切位点在Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu的羧基端的蛋白酶。本实验采用的AS.1398中性蛋白酶的酶切位点主要为Leu，碱性蛋白酶和风味蛋白酶作用位点广谱，胰蛋白酶作用位点在Lys和Arg之后，所以从酶的专一性和降压肽结构特点来说采用AS.1398中性蛋白酶为最佳用酶。

另一方面，经过酶的筛选实验，AS.1398中性蛋白酶的ACE抑制率在2h时达到了较高的84%，远高于其他蛋白酶；即使碱性蛋白酶的肽得率略高于AS.1398中性蛋白酶，但是本文研究的侧重点是ACE抑制率，肽得率只是辅助指标，所以本实验采用AS.1398中性蛋白酶为最佳用酶。

在AS.1398中性蛋白酶水解2h作用下，通过L9（34）正交实验得到最佳优化组合：pH7.0，温度50℃，底物浓度5%，加酶量[E]∶[S]为1.5∶100；并且加酶量[E]∶[S]在ACE抑制率和肽得率的方差分析（Fα=0.05）中有显著的影响。在最佳水解条件下检测肽得率与ACE抑制活性的关系表明，肽得率为58.64%时，水解液的抑制活性最大85.65%。

酶解后的玉米蛋白肽仍为混合物，建议下一步工作应分离并收集一系列单体化合物，以便专门研究结构与构效的关系，对具强ACE抑制性的肽段氨基酸序列作进一步分析和研究。

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Screenning of corn ACE inhibitory peptides hydrolase and optimization of enzymatic hydrolysis conditions

SONG Liang1，CAO Long-kui1，2，*，DIAO Jing-jing2，TONG Wan-bing1，LIU Hong-ru1
（1.College of Food，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China；2.Heilongjiang Agri-food Processing Development Centre，Daqing 163319，China）

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）16-0204-06

2011-11-21 *通讯联系人

宋亮（1986-），男，硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏。

大庆市高新区创新基金项目（DQGX08YF007）。