柿子多糖的分离纯化和结构分析

张瑞妮，张海生，赵 盈，张泽炎，张 怡，杜晓旭

陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710062

柿为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros kaki)植物，主要生长在热带、亚热带及暖温带地区，在中国、日本、意大利、巴西等国广泛栽培。中国传统医学认为，柿子味甘、涩，性寒，归肺经。《本草纲目》中记载:“柿乃脾、肺、血分之果也。其味甘而气平，性涩而能收，故有健脾涩肠，治嗽止血之功”［1］。多糖(polysaccharide)是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。多糖不但能治疗机体免疫系统受到严重损伤的癌症，也能治疗多种免疫缺损病症，如病毒性肝炎、风湿症等，甚至可以辅助治疗艾滋病和延缓衰老等［2］。因此，开发多糖资源，分析多糖结构和药理作用，具有极其重要的现实意义。

1 材料与仪器

1.1 材料

牛心柿(Diospyros kaki):采自陕西省西安市大居安村。

1.2 主要试剂

苯酚、浓硫酸、乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、三氯乙酸、吡啶、浓硫酸、乙醇和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等其它试剂等均为分析纯。

标准单糖:D-葡萄糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-半乳糖均为Sigma公司(纯度≥99.5%)。

Sephadex G-100葡聚糖凝胶(Pharmacia)。透析袋(分子截留量8000-12000):北京鼎国生物制剂公司。

1.3 仪器

RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);HHB-21CU-600电热恒温水槽(上海福玛实验设备有限公司);LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂);CS101-2AB电热干燥箱(重庆银河试验仪器有限公司);TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);真空冷冻干燥机(德国Christ Alphal-4);JY92-Ⅱ型超声波细胞粉粹机(宁波新芝生物科技股份有限公司);DBS-100电脑全自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂);高效液相色谱仪(Agilent公司);高效气相色谱仪(Agilent公司);U-3010紫外分光光度计(上海分析仪器厂);傅里叶变换红外光谱仪(德国Brucher公司)。

2 实验方法

2.1 柿子多糖粗品的制备

新鲜柿子洗净→去蒂→切片→烘干→粉碎→过40目筛→柿子粉→乙醚脱脂→抽滤风干→80%乙醇除杂(除去小分子糖、苷类、生物碱等)→超声波处理→热水浸提→离心→减压浓缩→醇沉→过滤→无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤→干燥→柿子多糖

2.2 柿子多糖的分离纯化

2.2.1 季铵盐沉淀法

将已称量好的2 g柿子粗多糖溶解于50 mL的双蒸水中，按体积比1∶1加入3%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，静置12 h后4000 rpm离心30 min。上清液部分按四倍体积加入95%乙醇，产生乳白色沉淀，分离沉淀并用去离子水溶解后装入透析袋，用流动自来水透析48 h，上清液真空冷冻干燥后得到白色絮状多糖WPP1。用10%的氯化钠水溶液将离心后的沉淀部分进行溶解，再加入四倍体积的95%的乙醇，产生浅棕色的沉淀，分离沉淀并用去离子水溶解后装入透析袋，流动自来水透析48 h，上清液进行真空冷冻干燥后得浅棕色多糖WPP2［3］。

2.2.2 Sephadex G-100 柱层析法

Sephadex G-100葡聚糖凝胶用适量蒸馏水沸水浴6 h，充分溶胀后，抽气装柱(层析柱规格2.4 ×45 cm)，平衡12 h。将季铵盐沉淀法分离得到的柿子多糖组分用少量蒸馏水溶解后上样。用蒸馏水洗脱，流速0.4 mL/min，分部收集器按每管3 mL进行收集，收集的100管洗脱液用苯酚-硫酸法检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集多糖。将收集液进行浓缩、透析、真空冷冻干燥［4］。

2.3 柿子多糖的纯度鉴定

采用高效液相色谱(HPLC)法对柿子多糖的纯度进行测定。称取柿子多糖适量，配制2 mg/mL浓度多糖溶液，进行HPLC分析。色谱柱采用SB804凝胶柱，流动相为高纯水，流速为0.8 mL/min，柱温为30℃，进样量为20 μL，检测器为示差折光检测器。

2.4 柿子多糖分子量的测定

采用高效液相色谱(HPLC)法对柿子多糖的分子量进行测定。色谱柱采用SB804凝胶柱，流动相为高纯水，流速为0.8 mL/min，柱温为30℃，检测器为示差折光检测器。

标准曲线的制作:以标准葡聚糖为标准品绘制标准曲线，葡聚糖浓度为2 mg/mL，进样量20 μL，以标准分子量的对数值为纵坐标，以色谱峰的保留时间为横坐标做标准曲线。

样品的测定:色谱条件同标准曲线，样品浓度为2 mg/mL，进样量为20 μL，利用标准曲线计算柿子多糖的相对分子量［5］。

2.5 柿子多糖单糖组成的测定

采用气相色谱法(GC)。称取5 mg经P2O5干燥的多糖样品溶于2 mol/L三氟乙酸(TFA)，于110℃条件下4 h使其完全水解。按照文献［6］方法制备糖腈乙酸酯衍生物，进行GC分析。对照标准单糖:D-葡萄糖(D-glucose)、D-甘露糖(D-mannose)、L-阿拉伯糖(L-arabinose)、D-木糖(D-xylose)、L-鼠李糖(L-rhamnose)、D-半乳糖(D-galactose)。色谱条件:ThermoTR-5石英毛细管柱(30 m ×0.32 mm)，FID检测器，程序升温至150℃保持1 min，以7℃/min速度升温至190℃保持2 min，以15℃/min速度升温至260℃保持2 min，进样温度为280℃，检测器温度为260℃。气流速度，氮气10 mL/min，空气200 mL/min，氢气 30 mL/min。

2.6 柿子多糖的光谱分析

2.6.1 紫外光谱分析

称取柿子多糖的两个组分各5 mg，分别配成5 mg/mL的水溶液。以蒸馏水为对照，190～900 nm区域紫外光谱扫描［7］。

2.6.2 红外光谱分析

称取柿子多糖的两个组分各1 mg，分别与100 mg的KBr混匀，研磨10 min，压片，4000 ～400 cm-1上红外光谱扫描［8］。

2.7 柿子多糖的环境扫描电镜观察

取柿子多糖WPP1、WPP2样品适量，粘附于带有双面胶的样台上，吹去未粘附的多糖粉末后置于离子溅射仪中喷镀导电金膜后，在Quanta 200环境扫描电镜下进行观察，拍照［9］。

3 结果与分析

3.1 柿子多糖的分离纯化和纯度鉴定

3.1.1 分离纯化

季铵基上的阳离子可与糖胺聚糖的阴离子形成季铵络合物(聚阴离子盐)极不溶于水，但能溶于一定浓度的无机盐。柿子多糖提取液经过季铵盐沉淀分离后得到了两个组分WPP1和WPP2。

为了得到均一多糖组分，将WPP1和WPP2采用凝胶层析柱进一步纯化，如图1(A、B)可知，WPP1和WPP2分别是以单一峰对称出现，表明WPP1和WPP2为均一多糖，可作进一步的结构分析。

图1 WPP1(A)及WPP2(B)的Sephadex G-100柱层析图Fig.1 Sephadex G-100 elution curves of WPP1(A)and WPP2(B)

3.1.2 纯度鉴定

采用季铵盐沉淀法和凝胶柱层析分离纯化的柿子多糖WPP1和WPP2经HPLC分析均为均一性多糖，如图2(A、B)所示。

图2 WPP1(A)及WPP2(B)的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of WPP1(A)and WPP2(B)

3.2 柿子多糖分子量的测定结果

对分子量已知的标准葡聚糖进行HPLC分析，以标准分子量的对数值为纵坐标，以色谱峰(标准葡聚糖)的保留时间为横坐标，绘制Mw-RT标准曲线，线性回归方程为 lgMw=8.9689+(-0.5545RT)，R2=0.9987，其中Mw为已知标准葡聚糖平均分子量，RT为标准葡聚糖的保留时间。

经分离纯化得到的柿子多糖的两个组分WPP1和WPP2的HPLC分析图谱如图2(A、B)所示，由回归方程计算出柿子多糖的两个组分WPP1和WPP2的平均分子量分别为2.05×105 Da和2.63×105 Da。

3.3 柿子多糖的单糖组成的测定结果

将标准单糖和柿子多糖WPP1和WPP2的水解产物分别进行衍生化，其糖腈乙酸酯衍生化后的GC图谱如图3(A、B、C)所示。由图谱比较分析可知，WPP1和WPP2在单糖组成上存在差异，WPP1由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖和D-半乳糖四种单糖组成，根据内标物的参比，由公式R1/2=f×(A1/A2)(其中f为校正因子，A为峰面积)计算得出，四种单糖的摩尔比为 0.8831∶0.6862∶0.7022∶1;而WPP2仅由L-阿拉伯糖和D-半乳糖两种单糖组成，其摩尔比为 0.8466∶1。

图3 混合标准单糖(A)、WPP1(B)及WPP2(C)水解产物气相色谱图谱Fig.3 Gas chromatogram of mixed monosaccharide standards(A)，the hydrolyzed WPP1(B)and WPP2(C)

3.4 柿子多糖的光谱分析

3.4.1 柿子多糖的紫外光谱分析

柿子多糖WPP1和WPP2的紫外扫描结果表明，WPP1和WPP2在200 nm处有多糖的特征吸收峰，而在260 nm及280 nm处均无吸收峰，说明WPP1和WPP2不含核酸和蛋白质，在可见光部分也无吸收峰，说明不存在色素。

3.4.2 柿子多糖的红外光谱分析

柿子多糖WPP1和WPP2的红外光谱扫描结果如图4和图5所示。

图4 WPP1的红外光谱图Fig.4 IR spectrum of WPP1

多糖样品在3421.51 cm-1处的强吸收峰，是O—H键的伸缩振动吸收;1650.43 cm-1处的吸收峰是结合水的吸收;1445.74 cm-1为C—O伸缩振动，这组峰的存在说明柿子多糖WPP1中含有-COO基团;1098.64 cm-1和 1000.74 cm-1处的吸收峰为 C—O伸缩振动，说明 WPP1中含有 C—O—C基团;836.09 cm-1的吸收峰为α-端基差向异构的CH变角振动峰，说明WPP1中含有α糖苷键化合物。640.30 cm-1处为吡喃糖骨架对称伸缩振动吸收峰。

图5 WPP2的红外光谱图Fig.5 IR spectrum of WPP2

由WPP2的光谱图可知，WPP2具有多糖类物质的特征吸收峰，3443.76 cm-1处的强吸收峰，是OH键的伸缩振动吸收;1641.53 cm-1处的吸收峰是结合水的吸收;1556.98 cm-1处的吸收峰是由C=O的非对称伸缩振动引起的;1414.59 cm-1为C-O伸缩振动，这组峰的存在说明柿子多糖WPP2中含有-COO基团;1080.84 cm-1处的吸收峰为C-O伸缩振动，说明柿子多糖WPP2中含有C-O-C基团;600.25 cm-1处为吡喃糖骨架对称伸缩振动吸收峰［10］。

3.5 扫描电镜(SEM)观察结果

柿子多糖的环境扫描电镜结果如图6(A、B)。由柿子多糖的环境扫描电镜照片可知，在高倍镜下(×2000)可以看到柿子多糖WPP1呈片状固体。更高倍镜下(×5000)可以清楚的观察到片状的WPP1上附着有大小不等的颗粒状聚集体，大小在0.1 μm ～ 1.5 μm 之间，这些颗粒状聚集体可能借助于糖链及其分支较多的氢键或其它弱作用力聚集或联接。说明WPP1为一种复合物，因为蛋白质不 可能去除完全，所以可能为糖蛋白复合物。

图6 WPP1的扫描电镜图Fig.6 SEM images of WPP1

4 结论

柿子粗多糖经季铵盐沉淀和凝胶柱层析分离纯化后得到了水溶性的WPP1和10%氯化钠盐溶性的WPP2两个多糖组分;柿子多糖组分WPP1和WPP2经Sephadex G-100柱层析、紫外光谱扫描及高效液相色谱法鉴定均为均一多糖，不含蛋白质、核酸和色素;高效液相色谱测定柿子多糖WPP1和WPP2的分子量分别为 2.05 ×105 Da、2.63 ×105 Da;柿子多糖WPP1和WPP2在单糖组成上存在差异，WPP1由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖和 D-半乳糖四种单糖组成，四种单糖的摩尔比为0.8831∶0.6862∶0.7022∶1。WPP2 由 L-阿拉伯糖和 D-半乳糖两种单糖组成，其摩尔比为0.8466∶1;红外光谱(IR)分析结果表明，WPP1是含有有α糖苷键的化合物，WPP1和WPP2均表现出吡喃糖的特征吸收;环境扫描电镜(SEM)结果WPP1为附着有大小在0.1 μm ～1.5 μm之间的颗粒固体的片状聚集体，可能为糖蛋白复合物。

要对柿子多糖的结构完全了解还需要多种化学方法、仪器分析方法和生物方法如免疫学、酶学方法的结合才能完成。关于柿子多糖的详细结构信息还有待进一步研究。

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