蛇钩口线虫长沙分离株ITS基因的克隆及序列分析

王 挺，李 芬，何 鑫，段柳春，林 源，盛晓枫，刘 伟，刘 毅

(湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128)

钩口线虫(Hookworm)属于线虫纲(Nematoda)圆线虫目的钩口线虫属(Ancylostoma)，严重感染时可以引起肠炎，是一种危害严重的人畜共患寄生虫。目前，在热带和亚热带国家钩虫感染人数超过7.4亿[1]。传统的寄生虫种类鉴定主要以形态学特征为主要依据，这对成虫的鉴定有一定准确性，但对于相近种，特别是虫卵和幼虫，形态学特征存在很大局限性。针对这种情况，选择以基因为分子标记进行这些方面的研究，大大促进了寄生虫分子分类学的发展[2-3]。核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区 (ITS)为介于18S和28S之间的内转录间隔区，包括ITS-1和ITS-2两段序列。ITS序列存在于高度重复的核糖体中，在生物进化过程中显示种的特征。近年来的研究表明：rDNA的ITS序列为寄生虫的鉴定提供了遗传标记[4-6]。本研究分析长沙蛇体内采集的钩口线虫ITS的遗传变异情况，为蛇钩口线虫进一步的分子遗传学研究和诊断研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 虫体样品 蛇钩口线虫成虫样品分别采自长沙马王堆大王蛇(AD1)、长沙西长街大王蛇(AD2)和乌稍蛇(AD3)，分离后用70%酒精保存备用。

1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、PCR试剂、DL2000DNA Marker购自TaKaRa公司；蛋白酶K购自Merck公司；WizardRSV Genom ic DNA Purification System购自Promega公司。

1.3 样品DNA的制备 取出单个虫体，冲洗后加入 Nucleilysis solution 200μL，EDTA(pH8.0)50μL，再加Proteinase K 20μL，55℃消化2h。消化的虫体悬液按WizardRSV Genom ic DNA Purification System使用说明进行虫体DNA提取。

1.4 目的基因扩增及克隆 采用文献[7]的引物NC5和NC2扩增ITS，其序列为5'-GTAGGTGAAC CTGCGGAAGGATCATT-3'和5'-TTAGTTTCTTTTCC TCCGCT-3'，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增体系为25μL，扩增条件为：94℃5min；94℃ 30s、55℃30s、72℃1m in，38个循环；72℃5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收PCR产物，将其克隆于pGEM-T中，由华大基因生物有限公司进行测序。

1.5 ITS序列测定及分析 采用DNAStar 5.0软件，将ITS基因测序结果与GenBank中登录的代表性的线虫ITS序列十二指肠钩口线虫(A.duodenale，AB504715)、犬钩虫(A.caninum，AB501354)、锡兰钩虫(A.ceylanicum，DQ780009)、巴西钩虫(A.braziliense， DQ438069)、 狭 头 钩 虫 (U.stenocephala，AF194145)和羊钩虫(B.trigonocephalum，AY439022)进行相似性比对和线虫种系发育分析，以阔节裂头绦虫(D.latum)作为外群。利用Clustal X2.0及Mega 4.1软件对获得的3株蛇钩口线虫和GenBank中的代表性线虫ITS序列进行比对及计算遗传距离。利用Mega 4.1程序中的临接法(Neighbor-joining method，NJ)绘制种系发育树。临接法在软件默认设置下进行分析；最大简约法采用Branch and bound模型分析，采用自展检验(bootstrap test)估算所构建系统树的可靠性。

2 结果与讨论

2.1 ITS基因PCR扩增结果 以NC2和NC5为引物，从3个虫体样品DNA均扩增出约750bp的特异性片段，与预期ITS片段长度(734bp)相符(图1)。

M：DL2000标准分子量；1：AD1；2：AD2；3：AD3；4：阴性对照M:DL2000DNA Marker;1:AD1;2:AD2;3:AD3;4:Negative control

2.2 序列测定及分析 测序结果显示，以NC2和NC5为引物均扩增出蛇钩口线虫ITS片段大小为734bp，剔除引物后，均得到688bp的序列，对3条蛇钩口线虫ITS序列进行了种内比较，结果显示，3个不同个体间的ITS序列的差异为0.4%～1.0%；其样品差异主要是存在碱基置换(图2)。各长沙分离株之间相应序列的相似性为98.7%以上，长沙分离株与基因库中其它线虫ITS序列的同源性较低。碱基组成分析结果显示，3个样品的序列存在10个可以作为其遗传标记的基因位点(图2中核苷酸序列表现为A33G、C48T、A57G、G117A、A126G、T132C、G156A、T171C、G252A以及T279C)。

2.3 ITS系统发生树 采用NJ法建树方法构建的系统发生树显示，长沙分离株AD1、AD2、AD3之间相应序列的相似性均为98%以上，长沙分离株与基因库中其它线虫ITS序列的同源性均低于89%(图3)。3个长沙分离株ITS序列种间的变异远远大于种内的变异，表明ITS能够成为种间的遗传变异提供遗传标记。采用NJ法构建的进化树与其具有一致性，均显示出长沙各个地区分离株位于同一分支，系统发生树中的Bootstrap值较高，长沙市分离株所属的分支与其它线虫所属分支相隔较远，能够很好地得以鉴别。

图2 长沙市蛇钩口线虫rDNA ITS序列比较分析Fig.2Sequence comparison of hookworm ribosomal DNA ITS isolate from Changsha

在动物遗传关系分析中，尤其是对较低的分类阶元，如同属的种间及种内水平的谱系关系的确定，应用分子标记技术对核糖体基因组进行分析，也是目前广为应用的方法。核糖体DNA具有分子量小、结构简单、进化速度快、母性遗传、无组织特异性等特点，使之成为研究寄生虫分类鉴定和群体遗传的理想分子标记[8-10]。

图3 基于ITS基因序列以临接法所构建的自展一致树Fig.3The Bootstrap consensus phylogram of the stationary tree reconstructed by Neighbor-Joining(NJ)using ITS sequences

本研究结果表明，蛇钩口线虫长沙分离株ITS序列的种内相对保守，种间差异相对较大，表明ITS序列能够作为蛇钩口线虫的遗传标记用于蛇钩口线虫的鉴定。本实验所测的蛇钩口线虫长沙分离株的ITS序列在国内外属首次报道，研究结果为进一步研究蛇钩口线虫的群体遗传结构奠定了基础。

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