鸡痘病毒分离株及疫苗株整合网状内皮组织增生病病毒的基因分析

车国喜，孙洪磊，于 宏，李 超，刘立涛，刘思当*

(1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2.中国农业大学，北京100193；3.泰安市畜牧兽医局，山东泰安271018；4.夏津县畜牧兽医局，山东夏津253200)

禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)基因片段或全基因整合进鸡痘病毒(Fow lpox virus，FPV)已成为关注的焦点。国外陆续报道了FPV整合有REV前病毒基因序列，即野毒株中含有REV病毒全基因序列，疫苗中整合有REV的长末端重复序列(Long terminal repeat，LTR)片段或全基因序列[1-6]。在我国，自2004年丁家波、崔治中等首次报道FPV基因组中整合有REV基因[7]以来，近几年陆续有报道称分离到的FPV野毒株中含有REV前病毒全基因序列，疫苗株整合有REV的LTR片段或者是全基因序列[8-9]。FPV基因组中有完整REV前病毒基因组整合对养鸡业是一种的潜在危胁[5]。至今，FPV野毒株的REV整合区全基因分析以及有关FPV野毒株和疫苗株整合序列差异比较的报道尚属少见。因此，本研究通过基因分析，了解山东地区FPV野毒流行株整合REV序列的情况，同时比较FPV分离株和弱毒疫苗株自然整合REV前病毒序列的差异，评估国内当前使用疫苗的缺陷及潜在风险，进而为有效预防鸡痘及禽网状内皮组织增生病奠提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要试剂 14个FPV分离株为山东农业大学动科院临床病理学实验室于2008年~2011年间自山东各地送检的鸡痘典型病例中分离鉴定及保存，代号依次为1～14；5株疫苗代号依次为：V1、V2、V3、V4和V5，其中V5为进口疫苗株。LA Taq DNA聚合酶、r Taq、DL15000DNA Marker、胶回收试剂盒等购自TaKaRa公司。

1.2 实验动物及病毒扩增 9日龄～11日龄SPF鸡胚购自山东省农科院家禽所；痘病毒增殖按常规接种鸡胚的方法进行。

1.3 引物设计与合成 根据普遍整合位点，参考文献[1]设计合成两对扩增FPV整合区全长序列引物(表 1)。

1.4 PCR反应条件及产物纯化 P1/P2引物：93℃1min、55℃ 2min、68℃ 6.5m in，30个循环。P3/P4引物：93℃1m in、55℃2m in、68℃6m in，30个循环。201F/203R引物：用r Taq酶扩增：94℃1m in、56℃ 1min，72℃ 6.5min，30个循环。用LA Taq酶扩增：94℃50s、56℃30s、72℃9m in，30个循环。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并采用胶回收试剂盒回收、克隆于pMD18-T载体中由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

表1 引物序列Table 1Sequence of primers

1.5 测序及基因分析 对5个FPV疫苗株和随机挑选的4个分离株进行测序，测序结果采用DNA Star软件进行序列拼接、比对、同源性分析并生成基因进化树。

2 结果

2.1 FPV疫苗株及分离株的REV整合区PCR扩增结果 以疫苗直接提取的DNA为模板，采用特异性引物对201F/203R进行扩增。分离株以感染的鸡胚鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上的痘斑研磨液提取的DNA为模板，分别采用特异性引物对P1/P2和P3/P4进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明4株国产疫苗扩增片段大小相近(图2A)，约1400bp，而进口疫苗V5片段较大，约1700bp；14个分离株扩增片段大小基本相同，P1/P2引物对和P3/P4引物对均得到了预期大小分别为6300bp(图 2B)和 5900bp(图 2C)的片段。

A:PCR amplification of FPV vaccine strainswith 201F/203R primers;1-5:PCR products of V1,V2,V3,V4and V5;6:Negative control;M:DNA Marker

B:PCR amplification of FPV isolateswith P1/P2primers;1-14:PCR products of FPV isolates 1-14;15:Negative control;M:DNA Marker

图1 FPV疫苗株及分离株REV整合区PCR扩增结果Fig.1Amplification of REV integrated regions of FPV vaccine strains and isolates by PCR

2.2 基因分析

2.2.1FPV疫苗株的整合区基因分析测序结果表明4株国产疫苗扩增序列长度分别为1378bp、1381bp、1382bp和1381bp，将测序结果录入到GenBank中进行Blast显示，4个序列均由3部分组成，aa 1～aa 822均为FPV的ORF201基因编码，长822bp；第二部分均为REV的5'LTR，位于823bp～1015bp，长193bp；第3部分为FPV的ORF203，长分别 363bp、366bp、367bp和 366bp；这 4个整合LTR序列同源性高达100%，与FPV株AF006064(澳大利亚疫苗株)、AF198100(强毒株)、AY255633(分离株)和HP-438(高代次分离株)的同源性高达99.9%～100%。表明REV-LTR在FPV基因组中的存在具有很悠久的渊源。

但整合的LTR序列与REV的美国标准株SNV和中国标准株HA9901同源性分别为70.4%和76.3%(表 2)，与国外(APC-566)、台湾(Chicken 3337/05和Goose 3410/06)、中国大陆(HLJ071、ZD0708和HLJR0901)的REV分离株同源性均为99.0%。与国外分离的整合REV全序列的FPV野毒株(AF246698)的LTR序列同源性平均为100%(表2)，表明这些LTR整合序列与REV株的LTR序列同源性不尽相同，与REV标准株同源性较低，与近期分离的REV株LTR序列的同源性较高，而与已知的整合株LTR同源性则高达100%。基因遗传进化树分析也显示了这种关系(图2)。

表2 整合LTR序列的同源性图谱Table 2Homologymap of integrated LTR

图2 FPV疫苗株整合LTR基因进化树Fig.2 Genetic evolution tree of integrated LTR for FPV vaccine strains

然而，进口疫苗V5的片段长度为1638bp，其中整合的LTR长度为486bp，该LTR序列与REV标准株和已知REV株的同源性与4株国产疫苗相似，但与国外分离株的整合全长LTR序列的FPV AY255633的LTR序列同源性高达100%，与4株国产疫苗相比，进口疫苗V5整合的LTR片段相对较完整。

2.2.2FPV分离株的整合区基因分析随机选取的4个分离株5、10、12和14进行测序，拼接之后长度分别为10306bp、10306bp、10168bp和10304bp，这些序列均由3部分组成：第1部分为FPV ORF201的1bp～904bp，各株间相同；中间部分为整合的REV序列，5、10、12和14株该段长度分别为7938bp、7938bp、7799bp和 7936bp；第3部分为FPV的ORF203，长度1464bp。样品间整合区REV序列同源性为99.6%～100%(表3)，除分离株12(YY2010)在REV的gag基因有两段共138bp的缺失以外，其间差异甚微。

这些整合序列与美国分离的整合株整合区REV序列同源性最高，均在99.5%以上；与美国REV标准株SNV同源性平均为96.1%(95.9%～96.2%之间)，与国内REV标准株HA9901同源性平均为97.7%(97.4%～97.8%之间)，而与国内外分离的REV株的同源性差异不大，均在99%以上(表3)。以上结果表明山东地区的FPV分离株的整合区REV序列高度同源，与国外FPV整合株的整合区REV序列同源性最高，与国内外REV分离株的同源性较高并且差异不大，而与标准株的同源性较低。基因遗传进化树分析也显示了这种关系(图3)。

表3 FPV野毒株整合区基因的同源性图谱Table 3Homology of integrated sequences from FPV field strains

图3 FPV分离株整合区基因进化树Fig.3Genetic evolution tree of integrated sequences from FPV isolates

整合区LTR序列比较结果显示：4个分离株整合的LTR序列基本一致，5'LTR长度为517bp，3'LTR长度为222bp，与国内外已知的REV株相比，这些整合株的3'LTR变异较大，其长度明显缩短。

3 讨 论

REV序列在FPV疫苗株和野毒株中的整合已是普遍现象，但对于整合序列的报道并不多见。本研究根据普遍存在的整合位点，分别从FPV和REV基因设计上下游引物，在得到整合区全序列的同时，还避免了因REV游离病毒粒子存在导致的非特异性扩增。

本研究结果显示2008年～2011年间分离的山东地区14个FPV分离株整合REV前病毒的位置一致，均位于FPV-201ORF和203ORF之间，而且极其一致地整合了几乎完整的REV前病毒基因序列。整合的REV序列与国外分离的整合株同源性最高，与REV株同源性较高，但与REV标准株同源性较低。其中整合区LTR序列变异最大，尤其是3'LTR明显缩短，这表明整合的REV序列经过了修饰，使之与FPV序列之间的结合更适于两者的生存和复制，整合过程中的这种修饰与REV-LTR，尤其是3'LTR的明显缺失有关。国外也有类似报道[3-4,9]。分离株5、10和14的整合区序列高度同源，无论是整合的LTR基因还是中间的gag、pol和env基因均差异甚微，这有可能如现在报道的两株MDV所体现出来的现象[10]，即这3株FPV野毒株很有可能是来自同一个原始重组病毒，由该原始重组病毒在鸡群中形成的流行病毒株。而分离株12由于gag基因出现较区域缺失可能与其他3株来自不同的原始重组病毒。

然而，国内外不同厂家的5株疫苗，均仅仅整合了REV前病毒的5'LTR序列,这与国外报道的所有FPV疫苗中均存在REV-LTR序列一致[4]。这些LTR序列在长度上分为两种，国产疫苗整合的LTR长度相对于进口疫苗较小。对于疫苗整合片段大小不同，在疫苗效力、安全性等方面的差异有待进一步研究。

整合几乎全长REV前病毒序列的FPV已成为流行鸡痘的优势病毒株，关于整合野毒株的致病特性，国外有报道称整合的REV序列具有感染性，并且可以复制，同时引起感染鸡出现持续3周以上的病毒血症，并表现明显的免疫抑制作用[1-2,6]。本实验室前期的研究中显示FPV整合野毒株除表现痘病病变外，还表现某些REV的致病特性，造成感染鸡持续性的免疫抑制，使REV抗体转阳，并出现REV病毒血症[11-12]，进一步证实REV可以通过基因组整合于FPV而进行传播的推断。

但目前鸡痘的高发病率和免疫失败现象与REV前病毒序列整合相关的更多内在联系，整合部分或全部REV-LTR序列的FPV疫苗的安全性，以及这些疫苗对整合几乎全长REV前病毒序列的FPV野毒的免疫保护作用，目前未见深入的研究报道，应进一步研究探讨。

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