猪圆环病毒2型Rep蛋白ELISA抗体检测方法的建立

李 杰，葛 猛，罗 维，舒晓亮，蒋大良，李润成，李 波，刘国华，余兴龙*

(1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.怀化市动物防疫监督站，湖南怀化418000)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是 Tischer等于1974年在PK-15细胞中发现，被认为是猪肾细胞PK-15的污染物，而且是非致病性的病毒。该病毒无囊膜，基因组由一条单股圆环状的DNA链组成。1991年，加拿大学者首次提出断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)与 2型PCV(PCV2)有关[1]。目前国内外对PCV2疫苗进行了广泛研究，但疫苗免疫和自然感染的猪均会产生Cap蛋白抗体，目前的检测方法无法区分这两种抗体。

PCV2的Rep蛋白(Rep2)为病毒复制相关蛋白，只有病毒在动物体内增殖时才存在并刺激机体产生抗Rep蛋白抗体，因此利用Rep蛋白建立特异性间接ELISA方法，不仅可以作为PCV2血清抗体检测的新方法，还可以区分自然感染和疫苗免疫。目前国内暂无以Rep蛋白为包被抗原的ELISA方法；国外Eva Prez-Martn等用杆状病毒系统表达出PCV2的Rep蛋白并建立以其为包被抗原的ELISA方法，并与Cap2-ELISA方法结合使用对PCV2进行大规模血清学调查[2]。本实验将PCV2-Rep在E.coli中表达，以纯化重组Rep2蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法，用于血清中PCV2Rep蛋白抗体的检测。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 pET-28a(+)载体购自Novagen公司；E.coli感受态细胞DH5α和BL21(DE3)均由本实验室制备并保存；选择经韩国检测试剂盒和IFA法检测PCV2抗体均为阴性或阳性的血清作为阴阳性血清；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和口蹄疫病毒(FMDV)等标准阳性血清均来自检测试剂盒。

1.2 主要试剂 PFU DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs和IPTG购自北京鼎国生物公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶和蛋白质分子量标准(低)购自TaKaRa公司；DL5000DNA Marker、质粒提取试剂盒和DNA琼脂凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技公司；High-Affinity Ni-IDA Resin购自Novagen公司；蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo公司；96孔ELISA板购自美国Costa公司；辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG(HRP-IgG)购自Sigma公司；TMB底物购自美国KPL公司；韩国进口检测试剂盒购自韩国金诺公司；SB封闭液购自Thermo公司。

1.3 目的蛋白的表达与纯化 利用Lasergene Meg Align软件分析，参照GenBank登录序列(AY188355)由金思特科技(南京)有限公司人工合成PCV2-Rep，根据E.coli稀有密码子对序列进行优化，同时在序列两端分别加入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点。

采用EcoRⅠ和SalⅠ分别对PCV2-Rep和pET-28a(+)进行双酶切。回收目的片段并以T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细菌，37℃培养过夜，采用带Kan抗性的LB琼脂平板筛选，挑取单个菌落采用PCR和酶切鉴定阳性克隆，由北京华大基因研究中心进行测序。将构建的pET-Rep2重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态中，37℃ M 9ZB液体培养基中培养，以终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达3h，SDS-PAGE鉴定。

纯化目的蛋白，SDS-PAGE检测其纯度。回收纯化的蛋白样品测定蛋白浓度。

1.4 重组蛋白western blot分析 分别取诱导的全菌、上清液和沉淀与未诱导的全菌进行SDS-PAGE电泳，并进行western blot检测，增强型HRP-DAB底物显色试剂进行显色。

1.5 PCV2-Rep间接ELISA方法的建立及条件优化 将纯化的重组Rep2蛋白抗原以碳酸盐缓冲液分别作0.5μg/m L～16μg/m L 2倍倍比稀释，4℃包被24h。以5%脱脂奶粉，37℃封闭2h。以封闭液对 PCV2阴阳性血清分别进行 1∶25、1∶50、1∶100和1∶200倍稀释，组成方阵，37℃作用1h，酶标二抗(1∶20000)37℃作用30min，底物避光显色10min，终止反应，在酶联检测仪上读取OD450nm值，每个样品平行做2孔，取平均值(下同)。选择阳性血清的OD450nm值为1左右并且阴性血清OD450nm值较低的抗原浓度和血清稀释倍数，作为抗原最适包被浓度和血清稀释倍数。通过最佳封闭液、血清稀释液、血清作用时间、酶标二抗和底物作用时间的筛选，建立ELISA标准化程序。

1.6 阴阳性血清临界值的确定 选择经鉴定为阳性的血清，以建立的ELISA法进行检测，选择OD450nm值在1.0左右的血清作为参考阳性血清；相同方法选择OD450nm值为0.1左右的血清为参考阴性血清。本实验采用S/P值判定检测结果。用建立的ELISA方法检测30份已确定的阴性血清样品，取阴性血清平均OD450nm值+3×标准差为阳性临界值，样品OD450nm值/参考阳性血清OD450nm值为样品S/P值，阳性临界值/参考阳性血清OD450nm值为临界S/P值。

1.7 重复性、特异性和敏感性试验 在同样条件下，用同一批包被的酶标反应板，对8份被检血清重复检测4次，判定其批内重复性；用4个不同批次包被的反应板，对8份血清进行重复检测，判定其批间重复性。用建立的Rep2ELISA方法检测PRRSV、CSFV、PRV和FMDV标准阳性血清，进行交叉反应试验。将PCV2阳性血清平行倍比稀释进行ELISA方法的敏感性试验。

1.8 与韩国金诺公司PCV2诊断试剂盒的对比试验采用建立的Rep2ELISA方法与韩国金诺公司的PCV2诊断试剂盒同时检测118份血清，进行比较。

1.9与PCV2-Cap间接ELISA方法的对比试验采用建立的Rep2ELISA方法检测由本实验室保存的816份血清样品。并与本实验室已经建立的Cap2-ELISA方法进行比较。

2 结果

2.1 PCV2-Rep蛋白的诱导表达、纯化及western blot鉴定 以pET-Rep2为模板进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，在约1000bp处出现一条特异性片段(图1)，与目的片段相符。将诱导表达产物采用SDS-PAGE电泳鉴定，结果显示，目的蛋白与预期相符，分子量约为40ku(图2a)。纯化蛋白的纯度在95%以上，Rep2蛋白浓度为0.248mg/m L(图2)。Western blot结果显示PCV2-Rep蛋白诱导表达组在相应位置出现特异性条带(图2b)。表明重组Rep2蛋白能够与特异性血清反应。

2.2 间接ELISA方法的建立及条件优化 采用方阵滴定法测定和条件优化，最终确定抗原包被量为200ng/孔，血清稀释倍数为50倍，封闭液和血清稀释液均为5%脱脂奶粉，血清酶标二抗作用时间分别为45m in和30min，底物显色时间为10min，血清临界S/P值为0.3。

2.3 特异性试验结果 采用已经建立的Rep2ELISA方法检测PRRSV、CSFV、PRV和FMD标准阳性血清，S/P值均低于0.3，为阴性，表明本研究建立的方法特异性良好。

图1 重组质粒pET-Rep2的PCR扩增Fig.1The PCR identification of pET-Rep2recombinant plasm id

图2 重组Rep2蛋白的SDS-PAGE和western blot鉴定Fig.2Analysis of recombinant Rep2protein by SDA-PAGE and western blot

2.4 敏感性试验结果 按照最佳反应参数，将阳性血清稀释至1∶800进行ELISA试验，S/P值依然大于0.3，表明该方法敏感性较好。同时也表明本实验使用的阳性血清效价滴度为1∶800。

2.5 重复性试验 对8份血清4次重复检测，批间和批内重复性试验结果显示，阳性血清检测孔OD450nm值变异系数均小于10%(表1)。

表1 重复性试验结果Table 1Repeatability of ELISA test

2.6 与PCV2诊断试剂盒的对比试验结果 采用建立的方法对118份猪血清样品进行检测，阳性率为72.9%(86/118)，并与韩国金诺试剂盒检测结果比较，符合率为81.4%(表2)。

2.7 与PCV2-Cap间接ELISA方法的对比试验结果 将Rep2ELISA方法与本实验室建立的Cap2-ELISA方法检测结果进行比较，结果显示本研究建立的方法检测阳性率较低(表3)。

表2 与韩国试剂盒检测比较结果Table 2Comparison w ith South Korea Jinnuo Kit on 118clinical serum samples

表3 两种ELISA方法对临床血清样品PCV2抗体的检测结果Table 3PCV2antibodies of clinical serum sample test results by two ELISA method

3 讨 论

Western blot分析表明本实验得到的重组蛋白可以与特异性阳性血清反应，这与张停婷等实验结果一致[3]，因此以在E.coli中原核表达获取的重组蛋白Rep2可以作为一种候选抗原蛋白建立间接ELISA方法检测猪群中PCV2的抗体。

PCV抗体检测时常用方法有ELISA、免疫组织化学检测技术、免疫荧光法、IPMA和胶体金免疫层析法等，而ELISA以其操作简单、敏感性高、快速、易标准化等优点，常用于大规模血清学检测[1,4-5]。PCV2的Rep蛋白是病毒复制相关蛋白，但PCV2感染动物后均能够产生抗Rep2抗体[6]，因此，Eva等用杆状病毒系统表达的PCV2Rep蛋白建立了ELISA方法[2]，并与Cap2-ELISA方法结合使用，对107份临床样品进行了检测，表明该方法适合对PCV2和PMWS进行大规模血清学调查。本研究建立的方法与韩国金诺试剂盒比较，特异性较低，而那几份特异性有差异的血清均为4周龄～7周龄的小猪血清，这可能与断奶仔猪中抗Rep和Cap抗体消失的快慢有关。两者符合率为81.4%，表明该方法具有较好的临床应用价值，可以用于猪群PCV2-Rep蛋白抗体的检测。

Puvanendiran等对美国育肥猪的PCV流行情况做了调查，结果显示大部分猪PCV1血清阴性，而PCV2阳性率较高，达到80%[7]。李欣等用华中农业大学PCV2ELISA检测试剂盒检测南阳市屠宰场360份血清，阳性率为66.3%[8]。本实验同时用两种ELISA方法检测PCV2抗体，Rep2-ELISA方法检测阳性率为71.9%，而Cap2-ELISA方法检测阳性率为81.9%，阳性率和国内外检测结果基本相符，Cap2-ELISA方法的敏感性高于Rep2-ELISA方法，这可能与Cap蛋白是PCV2病毒主要结构蛋白并具有较高的免疫原性有关。

本研究通过原核表达和Ni2+亲和层析方法纯化获得重组Rep2蛋白，通过梯度滴定包被和条件优化，建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法，其具有较高特异性和敏感性，适用于PCV2的流行病学调查和防制工作。

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[8]李欣，魏连冬.2009年南阳市屠宰厂圆环病毒监测调查报告[J].中国动物检疫，2010，27(7)：58.