姜黄素对帕金森病多巴胺能神经元保护作用的实验研究

于嵩，王玥，王旭

（辽宁中医药大学基础医学院解剖组胚教研室，沈阳 110847）

帕金森病 （Parki nson′sdi sease，PD）是一种中枢神经系统的退行性疾病，以黑质部位的多巴胺能神经元变性坏死为主要病理特征。随着人们生活水平的提高和人口老龄化的加剧，PD已成为第四大致死疾病。因此，解析PD的发病机制以及寻找神经退行性疾病的治疗策略已经成为神经科学领域的一个热点。

姜黄素为常用传统中药，由于其安全性高且毒副作用小，且具有多方面的药理作用机制，近年来广泛用于治疗神经退行性疾病。本研究采用 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-m et hyl-4-phenyl-1，2，3，6-t et rahydropyri dine，M PTP）诱导PD小鼠模型，应用旷场实验、牵引实验、免疫组化染色、分析和W est ern bl ot检测手段，探讨姜黄素对多巴胺能神经元的保护作用及其发生机制，对将来实现姜黄素临床治疗PD提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

5月龄雄性C57BL/6小鼠30只，体质量均约25 g，随机分成3组，对照组、模型组和姜黄素治疗组。对照组小鼠正常饮食；模型组小鼠腹腔注射M PTP（30 mg/kg）连续5 d，间隔24 h；治疗组小鼠连续5 d腹腔注射M PTP（30 mg/kg），随后连续7 d腹腔注射姜黄素（50 mg/kg）。

1.2 方法

1.2.1 行为学检测：旷场实验根据Teng等［1］的方法，观察水平运动力和垂直运动力2个指标。牵引实验根据W ang等［2］的方法记录牵引评分。

1.2.2 免疫组织化学染色：常规免疫组化染色实验方法。

1.2.3 体视学和光密度分析：每只小鼠取脑切片5张，光镜照相，i pp6.0软件分析切片上TH和DAT阳性纤维的光密度值和GFAP阳性的细胞数量，以每组50张切片的平均值作为各组的数据。

1.2.4 W est ern bl ot：常规W est ern bl ot实验方法。

1.3 统计学分析

应用SPSS 13软件，One-wayANOVA分析数据，结果以±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素改善小鼠的行为学异常

旷场实验、牵引实验结果显示：模型组小鼠的水平运动力、垂直运动力以及牵引评分显著低于对照组小鼠。姜黄素给药7 d后，小鼠的水平运动、垂直运动和牵引评分显著增加。

2.2 姜黄素保护M PTP诱导的多巴胺能神经纤维减少

TH、DAT免疫组化结果显示：与对照组相比，模型组小鼠中脑纹状体的多巴胺能神经纤维显著减少；姜黄素治疗组小鼠中脑纹状体内的阳性神经纤维的数量明显增加。光密度分析结果显示：模型组小鼠中脑纹状体内TH、DAT免疫阳性产物的光密度值分别减少了43%和91%，姜黄素治疗组小鼠中脑纹状体内的TH到DAT标记的阳性纤维光密度分别增加到82%和36%。

2.3 姜黄素对M PTP诱导的星形胶质细胞激活的抑制作用

GFAP免疫组化结果显示：与对照组小鼠相比，模型组小鼠黑质内星形胶质细胞数量明显增高，姜黄素治疗明显减少了由M PTP激活的星形胶质细胞的数量（图1）。体视学结果显示模型组小鼠黑质内激活的星形胶质细胞数量比对照组小鼠高出2.5倍，而姜黄素干预后星形胶质细胞的数量降到正常对照组小鼠的1.5倍。

2.4 姜黄素对M PTP诱导的肿瘤坏死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）激活的抑制作用

W est ern bl ot结果显示：M PTP诱发了小鼠黑质的TNF-α明显增高，而给予姜黄素治疗后，M PTP诱发的TNF-α的增高得到显著抑制。

3 讨论

流行病学调查表明，印度人每天的饮食中包含约200 mg的姜黄素成份，从而使其PD和阿尔茨海默病的患病率明显要低于其他国家和地区。已经有一些研究证实姜黄素的神经保护机制是多方面的［3，4］。在行为学实验中我们发现姜黄素治疗能够提高模型组小鼠的水平运动评分、垂直运动评分和牵引评分；TH和DAT免疫组化染色结果则证实姜黄素能保护M PTP诱导的多巴能神经元的减少，这些结果首先验证了姜黄素具有对PD多巴胺能神经元的保护作用。

我们的W est ern bl ot结果证实小鼠腹腔注射M PTP后使黑质内TNF-α显著增高。TNF-α主要是由激活的单核/巨噬细胞分泌，是具有多种生物活性的多效细胞因子，主要与炎性反应等有关。同时，GFAP免疫组化染色结果显示模型小鼠黑质部位GFAP阳性星形胶质细胞的数量显著高于对照组。研究证实炎症反应参与了多巴胺能神经元退行性变［5］，而且有文献报道，星形胶质细胞的激活以及TNF-α的增多可能参与了脑内炎性反应过程［6，7］，因此我们认为增高的TNF-α可以促进星型胶质细胞的激活，从而进一步加重炎性反应。St ri vast ava等［8］报道了姜黄素具有抗炎和抗氧化作用，我们的W est ern bl ot结果显示了姜黄素均能抑制TNF-α的激活；GFAP免疫组化染色结果证实姜黄素给药可以减少模型小鼠黑质部位GFAP阳性星形胶质细胞的数量。根据以上结果，我们推测：姜黄素通过减少TNF-α的产生，抑制星形胶质细胞的激活，进而使激活的星形胶质细胞释放细胞毒性物质减少，最终起到了保护多巴胺能神经元的作用。

［1］Teng X，Sakai T，Liu L，et al.Attenuation of MPTP-induced neurotoxicity and locomotor dysfunction in Nucling-deficient mice via suppression of the apoptosome pathway［J］.J Neurochem，2006，97（3）：1126-1135.

［2］Wang W，Shi L，Xie Y，et al.SP600125，a new JNK inhibitor，protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinson′s disease［J］.Neurosci Res，2004，48（2）：195-202.

［3］Shuto T，Ono T，Ohira Y，et al.Curcumin decreases toll-like receptor-2 gene expression and function in human monocytes and neutrophils［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，398（4）：647-652.

［4］Tu CT，Han B，Yao QY，et al.Curcumin attenuates Concanavalin A-induced liver injury in mice by inhibition of Toll-like receptor（TLR）2，TLR4 and TLR9 expression ［J］.Int Immunopharmacol，2012，12（1）：151-157.

［5］Vila M，Jackson-Lewis V，Guegan C，et al.The role of glial cells in Parkinson′s disease［J］.Curr Opin Neurol，2001，14（1）：483-489.

［6］刘犇，陈清，郭江，等.白藜芦醇对脂多糖诱导的星型胶质细胞炎症损伤的保护作用［J］.南方医科大学学报，2011，12（31）：2052.

［7］Megan L，Steele，Stephen R，et al.Reactive astrocytes give neurons less support：implications for Alzheimer′s disease［J］.Neurobiol Aging，2012，33：423.e1-423.e13.

［8］Srivastava RM，Singh S，Dubey SK，et al.Immunomodulatory and therapeutic activity of curcumin［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（6）：331-341.