EMAP-Ⅱ对紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1相互作用的调节和机制

王佐周，刘丽波，薛一雪，刘云会

（中国医科大学1.基础医学院病理学教研室，沈阳 110001；2.基础医学院神经生物学教研室，沈阳 110001；3.附属盛京医院神经外科，沈阳 110004）

血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞、基膜和胶质细胞组成，相邻内皮细胞间的紧密连接能够封闭细胞间的缝隙，是血脑屏障主要的结构和功能基础。紧密连接主要由跨膜蛋白occludin、claudins家族、胞质附着蛋白ZOs家族及连接黏附分子等成分构成，它们的分布、表达水平以及蛋白之间相互作用的变化对紧密连接功能的调节至关重要［1］。虽然肿瘤组织部分破坏了血脑屏障，但仍然存在血肿瘤屏障（blood-tumor barrier，BTB），这限制了抗肿瘤药物进入肿瘤组织，严重影响了化疗疗效［2］。我们前期的研究结果显示，内皮—单核细胞激活多肽Ⅱ（endothelial-monocyte activating polypeptide Ⅱ ，EMAP-Ⅱ）能够通过下调内皮细胞的紧密连接相关蛋白occludin、claudin-5和ZO-1的表达水平，开放紧密连接，选择性地增加BTB的通透性，而对正常血脑屏障没有影响［3］。研究发现存在于内皮细胞膜上的α-ATP合酶被认为是EMAP-Ⅱ的功能受体，并且肿瘤的酸性环境使EMAP-Ⅱ与肿瘤组织血管内皮细胞膜上的α-ATP合酶的亲和力高于它与正常组织血管内皮细胞膜上α-ATP合酶的亲和力［4］，我们的研究证实EMAP-Ⅱ作用后通过选择性与肿瘤微血管内皮细胞膜上的α-ATP合酶结合，发挥选择性开放BTB的作用［5］。但EMAP-Ⅱ是否能够影响occludin和ZO-1的相互作用及其可能的调节机制均不清楚。研究显示，在调节紧密连接的信号分子中，PKC是调节紧密连接动态变化、影响细胞旁通透性的重要分子［6］。本研究旨在探讨EMAP-Ⅱ对紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的分布、定位和相互作用的影响，并分析其可能的调节机制，以明确EMAP-Ⅱ开放BTB紧密连接的分子机制，并为EMAP-Ⅱ的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：大鼠C6胶质瘤细胞株，由中国医科大学细胞生物实验室提供。

1.1.2 试剂和器材：EMAP-Ⅱ、葡聚糖和Ⅱ型胶原酶，购于Sigma Chemical公司；DMEM，购自Gibco公司；胎牛血清，购自天津H&Y生物公司；兔抗大鼠occludin和小鼠抗大鼠ZO-1抗体，购于Cell Signaling公司；TRICT标记的山羊抗兔、FITC标记的山羊抗小鼠二抗，购于北京中杉公司；PKC活性检测试剂盒，购于Calbiochem公司。二氧化碳培养箱（Forma Scientific），购于美国Thermo公司；超净工作台（SW-CJ-1FD），购于苏净集团安泰公司；台式低温超速离心机（3K18），购于德国Sigma公司；酶标仪（SpectraMax M5），购于美国MD公司；荧光显微镜（Olympus BX51），购于日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：随机分为7组（每组样本例数为6）：模型组、EMAP-Ⅱ 0.5 h 组、EMAP-Ⅱ 1 h 组、EMAP-Ⅱ 2 h 组、EMAP-Ⅱ 3 h 组、EMAP-Ⅱ 6 h 组和EMAP-Ⅱ12 h组。模型组仅给予生理盐水。

1.2.2 模型建立：取1周内的Wistar胎大鼠，无菌条件下取出大脑组织，去除肉眼可见的血管、大脑髓质、小脑及软脑膜，收集大脑皮质，匀浆后移入15%葡聚糖溶液中高速离心获得底部的“微血管层”。加入1 mLⅡ型胶原酶（1 mg/mL），37℃水浴中震荡消化，微血管段呈现“串珠样”表现时终止消化，加入培养液（DMEM培养液，20%热灭活的胎牛血清）轻柔吹打。用培养液稀释微血管段至密度为8×103/cm2，种植入1%明胶覆盖的培养瓶中培养，以后每3 d换培养液1次。常规培养C6大鼠胶质瘤细胞。按Hurst等［7］的方法建立体外BTB模型。先将1×106个C6胶质瘤细胞消化后接种于transwell微孔膜的反面，加入适量的培养基进行培养，待细胞长至约80%融合后，将1×105个大鼠脑微血管内皮细胞（rat brain microvascular endothelial cells，BMEC） 接种于微孔膜正面。共培养约7 d BMEC融合，此后每2 d换培养液1次，共同培养7～10 d后给予EMAP-Ⅱ进行后续实验。

1.2.3 体外BTB模型跨内皮细胞阻抗（transendothelial electrical resistance，TEER）值的测量：应用密理博公司的Millicell-ERS电阻测量系统测量，测量值与Transwell微孔膜的表面积的乘积为最终的TEER值，用 Ω·cm2表示。

1.2.4 双重免疫荧光方法检测occludin和ZO-1的分布、定位：EMAP-Ⅱ作用不同时间后，取出transwell膜，剪下多聚酯膜，应用多聚甲醛固定，PBS漂洗后，正常血清室温封闭30 min，加入occludin和ZO-1的抗体混合物（occludin 1∶200稀释，ZO-1 1∶200稀释），4℃孵育过夜，而后加入相应的FITC和TRITC标记的荧光二抗（1∶100稀释），避光室温孵育40 min，封片剂封片后在荧光显微镜下观察。

1.2.5 免疫共沉淀方法检测occludin和ZO-1的结合：EMAP-Ⅱ作用不同时间后，弃去培养液后用PBS漂洗，应用非变性裂解缓冲液提取BMEC细胞的蛋白提取物，将细胞裂解物与ZO-1抗体4℃缓慢摇动孵育过夜，加入蛋白G微珠孵育4℃缓慢摇动4 h，而后4℃离心5 min（3 302 r/min）获得沉淀，应用蛋白裂解液洗涤沉淀3～5次，向沉淀中加入电泳上样缓冲液，100℃煮沸5 min，离心后取上清应用occludin多克隆抗体进行Western blot检测，分析occludin与ZO-1结合水平。

1.2.6 PKC活性检测：常规裂解液提取BMEC总蛋白，并进行蛋白定量，按照PepTag PKC活性检测试剂盒说明书进行磷酸化反应30 min，然后电泳15 min，紫外灯下观察，电泳后磷酸化与非磷酸化的底物肽C1被分离，磷酸化的底物向正极移动，非磷酸化的底物向负极移动。将各组磷酸化条带按等体积切除（约 250 μL）并加热熔解，将 125 μL 上述热琼脂糖转移到一个装有75 μL溶胶液和50 μL冰乙酸的管中。快速涡旋振荡后，转移至96孔板中，在570 nm波长读吸光度值。用不含PepTag誖短肽的液态琼脂糖做空白清零。PKC的活性单位以每分钟每毫升蛋白溶液中使底物肽C1磷酸化的纳摩尔数（nmol·min-1·mL-1）表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 EMAP-Ⅱ对体外BTB模型TEER值的影响

如表1所示，EMAP-Ⅱ作用后体外BTB模型的TEER值显著降低，通透性显著升高。在EMAP-Ⅱ作用0.5 h时TEER值开始降低，作用1 h时效果最显著，而后逐渐升高，在12 h时基本恢复至EMAP-Ⅱ作用前水平。

表1 E M A P-Ⅱ对体外B T B模型T E E R和P K C活性的影响T a b.1 E f f e c t o f E M A P-Ⅱo n T E E R a n d P K C a c t i v i t y o f B T B i n v i t r o G r o u p n T E E R P K C a c t i v i t y M o d e l 6 1 5 7.5 6±7.7 5 0.4 3 2±0.0 2 2 E M A P-Ⅱ 0.5 h 6 1 3 4.2 7±6.9 1 1） 0.6 9 5±0.0 3 5 1）E M A P-Ⅱ 1 h 6 1 1 3.4 2±6.0 7 1） 0.9 8 8±0.0 4 2 1）E M A P-Ⅱ 2 h 6 1 2 8.5 9±6.4 3 1） 0.7 9 4±0.0 3 9 1）E M A P-Ⅱ 3 h 6 1 3 9.6 3±7.1 4 2） 0.6 3 6±0.0 3 3 2）E M A P-Ⅱ 6 h 6 1 4 4.4 7±7.3 8 0.5 4 2±0.0 3 1 E M A P-Ⅱ 1 2 h 6 1 5 2.9 1±7.7 9 0.4 7 5±0.0 2 5 1）P<0.0 1 v s m o d e l g r o u p；2）P<0.0 5 v s m o d e l g r o u p.

2.2 EMAP-Ⅱ对紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的分布、定位以及结合能力的调节

由于TEER结果显示EMAP-Ⅱ作用1 h时增加BTB通透性的效果最显著，因此双重免疫荧光和免疫共沉淀实验选择模型组和EMAP-Ⅱ1 h组进行研究。双重免疫荧光结果显示，在模型组紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1在BMEC的细胞边缘呈连续分布，二者存在共定位；EMAP-Ⅱ作用后，能够使occludin和ZO-1在BMEC的细胞边缘的分布减少，呈现不连续分布，并且二者在细胞边缘的共定位减弱（图2）。免疫共沉淀结果证明，在BMEC中occludin和ZO-1能够相互结合，EMAP-Ⅱ作用后二者的结合减弱（图3）。

2.3 EMAP-Ⅱ对PKC活性的影响

模型组的BMEC中有一定的PKC活性，EMAP-Ⅱ作用能够显著增加PKC的活性，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h时PKC活性开始升高，作用1 h时达峰值，而后逐渐降低，在12 h时基本恢复至EMAP-Ⅱ作用前水平（表 1）。

3 讨论

本研究发现，EMAP-Ⅱ能够降低体外BTB模型的TEER值，增加BTB通透性；改变体外BTB模型BMEC中紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的分布，降低二者的结合能力；同时我们发现，EMAP-Ⅱ能够增强BMEC中PKC的活性，并且PKC活性增强的变化时相与上述指标的变化时相相同，提示EMAP-Ⅱ可能通过PKC途径调节紧密连接相关蛋白的相互作用，增加BTB通透性。

脑胶质瘤是临床最常见的神经系统恶性肿瘤之一，严重影响人类健康。除手术治疗外，化疗是脑胶质瘤术后治疗的主要手段之一，但由于BTB的存在限制了抗肿瘤药物进入中枢神经系统，严重影响了化疗效果［7］。为了有效地将药物转运到脑肿瘤组织，切实提高脑胶质瘤的治疗效果，过去的十几年里科学家们一直在寻找能够有效开放BTB的物质，研究显示如果肿瘤组织的药物浓度提高2倍，其治疗效应则增加10倍。EMAP-Ⅱ是从肿瘤细胞的培养液中发现的，由其前体物质proEMAP-Ⅱ分解而成，能够调节内皮和单核细胞的功能，目前对EMAP-Ⅱ作用的研究主要集中于其抗肿瘤作用［8］，EMAP-Ⅱ能够选择性开放BTB是我们研究小组近期的研究结果［3，5］，如果能充分利用 EMAP-Ⅱ的抗肿瘤特性和选择性增加BTB通透性的作用，不仅可以使治疗药物靶向进入肿瘤组织，而且能够显著提高药物疗效，减少药物的不良反应。但关于EMAP-Ⅱ开放BTB紧密连接的分子机制仍需深入探讨。

跨膜蛋白occludin、claudin-5和胞质附着蛋白ZO-1是构成紧密连接的主要蛋白。ZO-1是第一个被确定的紧密连接相关蛋白，具有种属依赖性，在内皮细胞的紧密连接处尤为丰富，它是连接跨膜蛋白（如occludin和claudin-5）和细胞骨架蛋白actin的桥梁［9］。ZO-1属于膜相关的鸟苷酸激酶样蛋白家族，具有该家族成员所含有的3个保守的蛋白区域：PDZ区域、SH3区域和GUK区域。PDZ1区域直接与跨膜蛋白claudins的羧基末端相结合，而GUK区域则与跨膜蛋白occludin相互作用；另一方面ZO-1的羧基末端与细胞骨架蛋白actin相连［1］，这样就通过ZO-1将跨膜蛋白定位于紧密连接，维持紧密连接的结构与功能。如果上述蛋白的分布或相互作用发生改变，能够直接影响紧密连接的完整性，进而影响血脑屏障的通透性。本研究结果显示，EMAP-Ⅱ能够减少紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1在BMEC的细胞膜上的表达，并减弱二者在BMEC的结合，提示EMAP-Ⅱ可能通过影响occludin和ZO-1的相互作用，使锚定在内皮细胞间紧密连接上的occludin减少，破坏紧密连接相关蛋白与细胞骨架蛋白的结构，诱导紧密连接开放，增加BTB通透性。

PKC是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，几个主要的紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5都具有多个PKC磷酸化位点，PKC激活后能通过磷酸化紧密连接相关蛋白并诱导其重分布，发挥直接调节紧密连接的作用［10］。研究显示，PKC磷酸化肠上皮细胞 ZO-1后能够降低 ZO-1与 occludin、ZO-1与claudin-1之间的相互作用，增加上皮细胞通透性［11］，但EMAP-Ⅱ是否通过PKC途径调节紧密连接相关蛋白之间的相互作用尚不清楚。为此本研究应用PKC活性检测试剂盒检测了EMAP-Ⅱ对PKC活性的影响，结果显示EMAP-Ⅱ能够显著增强PKC的活性，并且PKC活性的变化时相与体外BTB模型通透性的变化时相以及紧密连接相关蛋白的分布和相互作用的变化时相一致，提示EMAP-Ⅱ可能通过PKC途径调节紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1之间的相互作用，进而开放紧密连接，增加BTB的通透性。

综上所述，我们的研究结果提示EMAP-Ⅱ能够通过减少紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1在BMEC细胞膜的表达，减弱二者的结合，增加BTB通透性，信号分子PKC可能参与了这一过程。本研究进一步明确了EMAP-Ⅱ选择性开放BTB紧密连接的分子机制，为EMAP-Ⅱ的临床应用提供了理论和实验依据。

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