穿山龙总皂苷对胶原诱导性关节炎大鼠关节滑膜组织NF-κB p65活性及STAT3表达的影响

高亚贤，梁秀军，董文娟，肖丽君，宋鸿儒

（承德医学院免疫学教研室，河北 承德 067000）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜炎症为特征，以多对称性关节炎为主要临床表现的异质性、系统性的慢性自身免疫功能障碍性疾病，其病理特征为滑膜细胞增生、血管新生增多、血管翳形成等。血管新生和血管翳的形成在RA的发生发展过程中起了至关重要的作用。抑制滑膜新生血管形成，减少血管翳的血液供应，可以阻止血管翳的生长和进一步对软骨、骨的破坏，可能是治疗RA的一种重要方法［1，2］。本课题组前期研究发现穿山龙总皂苷对胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠关节滑膜组织的新生血管数量及对血管形成具有特异性的因子——血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达水平具有显著性的抑制作用，但其作用机制尚不完全清楚［3］。已有研究表明，核转录因子κB（nuclear transcription factors-κB，NF-κB）与血管翳生成、关节软骨侵蚀密切相关［4］，通过抑制NF-κB的活性可减少VEGF的产生［5］，另有研究发现，JAKSTAT信号转导通路的重要底物信号转导子和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）蛋白可以直接调节VEGF的表达。因此，本研究通过观察穿山龙（rhizoma dioscreae nipponicae，RDN）总皂苷对CIA大鼠滑膜组织中NF-κB p65及STAT3蛋白表达的影响，旨在从信号转导通路方面探索穿山龙总皂苷治疗类风湿性关节炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康Wistar大鼠80只，雌雄各半，体质量（160±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：0189066，许可证号SCXK（京）2006-0009。

1.2 药物与试剂

牛Ⅱ型胶原购自美国Chondrex公司，弗氏完全佐剂（CFA）购自 Sigma公司，Nuclear Extract Kit，TransAMTMNF-κB p65活性检测试剂盒，Recombinant NF-κB p65 protein均购自美国 Active Motif公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Pierce公司，兔抗STAT3单克隆抗体购自美国Epitomics公司，兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RDN由承德医学院中药研究所提取。雷公藤多甙片购自黄石飞云制药有限公司，薯蓣皂苷元购自南京泽朗医药科技有限公司，穿山龙水溶性薯蓣皂苷片购自东盛科技股份有限公司西安制药厂。

1.3 CIA模型的建立

将溶于醋酸的牛Ⅱ型胶原（2 mg/mL）与CFA等体积混合，充分乳化，制成Ⅱ型胶原乳剂。大鼠用10%的水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后，在无菌条件下，于大鼠背部及尾根部多点注射（每只0.2 mL）配制好的Ⅱ型胶原乳剂，7 d后按上述方法、相同剂量加强1次，作为激发注射。正常对照组按同样的方法注射等体积的生理盐水。用关节炎指数（AI）作为判断模型是否成功的标准。肢体关节肿胀按0～Ⅳ级评分：0，无红肿；Ⅰ，趾关节稍肿；Ⅱ，趾关节及足趾关节肿胀；Ⅲ，踝关节以下足爪肿胀；Ⅳ，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。AI值=四肢肢体关节肿胀级评分之和（Ⅰ级为1分，总分为16分）［6］。AI≥4分为造模成功。

1.4 实验动物分组及给药

80只Wistar大鼠，随机选取12只作为正常对照组，其余68只大鼠均建立CIA模型，将造模成功的60只CIA大鼠随机分为CIA模型组（CIA）、雷公藤组（TP）、穿山龙总皂苷组（RDN）、薯蓣皂苷元组、穿山龙水溶性皂苷片组，每组各12只。在初次免疫后16 d起，雷公藤组大鼠给予雷公藤多甙片（12 mg·kg-1·d-1）灌胃，穿山龙总皂苷组大鼠给予穿山龙总皂苷（25 mg·kg-1·d-1）灌胃，薯蓣皂苷元组大鼠给予薯蓣皂苷元（25 mg·kg-1·d-1）灌胃，穿山龙水溶性皂苷片组大鼠给予穿山龙水溶性皂苷片（45 mg·kg-1·d-1）灌胃，正常组和CIA模型组大鼠分别给予等体积溶媒（0.5%CMC）灌胃，各组连续用药时间均为35 d。

1.5 取材

每组随机选择6只大鼠，用10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉后，仰面固定，经腹腔静脉取血处死，立即分别沿着双侧后腿膝关节正中纵行剪开皮肤，充分暴露出膝关节，沿髌骨上缘约0.3～0.4 cm处向下切割至胫骨，打开膝关节腔，用眼科镊完整取下滑膜组织，标记，迅速置于液氮中保存，用于TransAMTMNF-κB p65活性检测。剩余6只大鼠按同样方法迅速取下滑膜组织，置于Bouin液中固定，用于检测STAT3的免疫组织化学染色。

1.6 NF-κB p65 活性测定

1.6.1 滑膜细胞核蛋白的提取：参照Nuclear Extract Kit说明书的操作步骤，提取滑膜细胞的核蛋白，采用二辛可酸法（BCA分析法）测定样本核蛋白的浓度，将样本蛋白分别溶解成1∶50、1∶100的浓度，用酶联仪准确测量，最后计算取平均值作为核蛋白的浓度。将核蛋白分装置于-80℃保存备用。

1.6.2 TransAMTM检测 NF-κB p65的 DNA活性：TransAMTMNF-κB p65活性检测试剂盒内含一个96孔板，板上包被有NF-κB同源序列（5′-GGGACTTTC C-3′）的寡核苷酸，细胞核内活化的NF-κB可以特异性地结合到寡核苷酸。参照试剂盒说明书设立空白对照孔（不加入细胞核提取物）、阳性对照孔、特异性或非特异性竞争对照孔（加入野生型或突变型同源寡核苷酸）、recombinant protein孔及各样品核蛋白孔。首先向各检测孔中分别加入30 μL完全连接缓冲液或30 μL含有2 μL特定寡核苷酸（野生型或突变型）的完全连接缓冲液；再加入20 μL含有相同质量各样本核提取物或含有1 μL Jurkat（阳性对照）的完全裂解缓冲液，Recombinant protein孔中依次加入20 μL梯度液，封板，室温下摇床孵育1 h；然后依次经 NF-κB p65 抗体（1∶1 000），HRP-标记的二抗（1∶1 000）室温孵育，最后每孔加入室温的显色剂和终止液，5 min之内450 nm波长测量出吸光度值，通过标准曲线，换算成ng值，得到蛋白含量。

1.7 用免疫组织化学染色（SP法）检测滑膜组织STAT3的表达

取大鼠滑膜组织固定的标本，常规脱水、透明、石蜡包埋，连续5 μm切片，脱蜡至水以后操作按试剂盒说明书进行，滴加1∶50的兔抗STAT3单克隆抗体，用PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色剂室温显色，苏木素复染。免疫组织化学染色以细胞质和/或细胞核中出现清晰棕黄色颗粒为阳性细胞。采用MiVnt图像分析系统，以免疫阳性产物面积占视野面积的比值作为STAT3蛋白的相对表达水平。每只大鼠选取6张切片，每张切片观察3个视野，取平均值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 CIA大鼠治疗前后AI评分

大鼠初次免疫后14 d逐渐出现足趾部及踝关节皮肤发红，轻度肿胀等关节炎症状。造模成功分组以后分别于 16、23、30、37、44、50 d 检测各组大鼠AI评分，CIA模型组大鼠AI值与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；穿山龙总皂苷组、雷公藤组、薯蓣皂苷元组、穿山龙水溶性皂苷片组可明显抑制CIA大鼠AI值（P＜0.01）；各治疗组之间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同时间各组大鼠AI评分（±s，n=12）Tab.1 AIofeach group rat s′ paw s i n di f f erentt i m e poi nt s（±s，n=12）Group 16 d 23 d 30 d 37 d 44 d 50 d Normal control 0 0 0 0 0 0 CIA 3.29±0.201） 8.59±0.601） 7.87±0.521） 6.54±0.361） 5.50±0.211） 4.54±0.301）TP 3.36±0.20 6.69±0.382） 6.42±0.242） 5.45±0.522） 4.03±0.552） 3.54±0.562）RDN 3.30±0.24 6.67±0.512） 6.43±0.232） 5.38±0.422） 4.57±0.322） 3.55±0.242）Diosgenin 3.31±0.16 6.75±0.322） 6.40±0.132） 5.48±0.382） 4.64±0.132） 3.86±0.242）Diosgenin tablets 3.25±0.12 6.68±0.352） 6.24±0.182） 5.77±0.212） 4.67±0.182） 3.58±0.122）1）P ＜ 0.01 vs normal control group；2）P ＜ 0.01 vs CIA model group.

2.2 TransAMTMNF-κB p65 kit检测CIA大鼠滑膜细胞核NF-κB p65的DNA结合活性

CIA模型组与正常对照组比较，大鼠滑膜细胞核蛋白提取物中NF-κB p65的DNA结合活性显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与CIA模型组相比，穿山龙总皂苷组、雷公藤组、薯蓣皂苷元组、穿山龙水溶性皂苷片组的NF-κB p65 DNA结合活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；各治疗组之间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见图1。

2.3 关节滑膜组织STAT3蛋白的表达情况

STAT3阳性信号主要分布于细胞质，少量在细胞核中。STAT3蛋白在CIA模型组大鼠关节滑膜中的表达与正常对照组相比显著增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；与CIA模型组相比，穿山龙总皂苷组、雷公藤组、薯蓣皂苷元组、穿山龙水溶性皂苷片组STAT3蛋白的表达显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；各治疗组之间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图 2，表 2。

3 讨论

表2 各组大鼠滑膜组织S T A T 3蛋白表达情况（±s）T a b.2 E x p r e s s i o n o f S T A T 3 p r o t e i n i n s y n o v i u m o f r a t s i n e a c h g r o u p（±s）G r o u p n S T A T 3（%）N o r m a l c o n t r o l 6 0.4 4 8±0.3 5 4 C I A 6 1 1.6 6 9±2.3 7 4 1）T P 6 2.8 3 6±1.6 2 5 2）R D N 6 3.2 8 1±1.3 7 4 2）D i o s g e n i n 6 3.1 0 5±1.6 4 8 2）D i o s g e n i n t a b l e t s 6 2.8 2 6±1.2 8 2 2）1）P ＜ 0.0 1 v s n o r m a l c o n t r o l g r o u p；2）P ＜ 0.0 1 v s C I A m o d e l g r o u p.

RA是一种以关节滑膜增生，血管翳形成及对称性、破坏性的关节病变为主要病理特征的慢性自身免疫性疾病，其发病机制尚不十分清楚。VEGF及其受体在血管新生中起着最关键的作用，调控着内皮细胞的增殖、迁移、管腔形成等重要环节［7］。IL-1、TNF-α均可刺激VEGF的表达，进一步促进血管新生。宋鸿儒等［8］早期研究证实穿山龙水煎剂具有免疫抑制作用。穿山龙总皂苷是从RDN的干燥根中提取的有效成分。本课题组前期大量实验的研究表明，穿山龙总皂苷对佐剂性关节炎有一定的治疗作用［9］，还可以抑制 CIA 大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的水平，减少CIA大鼠膝关节滑膜新生血管数量，显著性下调VEGF及其受体Flk-1的表达［3］。本实验中，穿山龙总皂苷可以显著抑制CIA大鼠的AI值。这些治疗作用所通过的信号转导途径需要进一步研究。

NF-κB是RA滑膜炎性反应发生发展的一条重要炎性细胞信号转导途径。NF-κB与κB抑制蛋白（inhibitory κB，IκB） 相结合于静止期细胞的细胞质中，随着IκB的磷酸化和降解，NF-κB被释放游离并转移至细胞核并激活靶基因表达。这一经典途径中触发激活作用最明显的是p65亚单位的磷酸化。Benito等［4］采用免疫组织化学及凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）对早期RA患者关节组织的配对研究显示，在软骨与血管翳交界部位（CPJ），NF-κB阳性细胞绝对值显著高于关节内其他非CPJ部位，提示NF-κB与血管翳生成、关节软骨侵蚀密切相关。在高表达NF-κB的裸鼠胰腺癌移植瘤中封闭NF-κB的表达，将下调VEGF，IL-8等多种促血管生成因子，推测在基因水平上NF-κB调节着VEGF的表达［10］。另有研究发现在CIA大鼠滑膜组织中NF-κB与VEGF两者表达显著正相关，提示在RA中两者作用密切相关，NF-κB可能参与了VEGF基因的转录调控，通过正向调节VEGF的表达，进而影响滑膜血管翳的形成［11］。本实验选择的阳性对照药物雷公藤是目前治疗RA药物中疗效最被肯定的单味中药。雷公藤内酯醇可以通过抑制核转录因子如NF-κB的活性来减少VEGF的产生［5］。课题组前期实验中表明穿山龙总皂苷能显著性下调CIA大鼠关节滑膜组织中VEGF及其受体Flk-1的表达，本研究应用TransAMTMNF-κB p65活性检测试剂盒可以快速、高敏感性、定量分析核转录因子的活性，采用ELISA方式进行敏感的特异性检测，其灵敏度是传统凝胶电泳迁移率实验法（EMSA）的10倍，结果亦发现，CIA模型组大鼠关节滑膜组织中NF-κB p65的DNA结合活性显著增高，穿山龙总皂苷治疗组能显著降低其NF-κB p65活性，其治疗效果与雷公藤阳性对照组、薯蓣皂苷元组、穿山龙水溶性皂苷片组相比较，差异无统计学意义，提示穿山龙总皂苷可能通过抑制NF-κB p65 DNA结合活性下调VEGF的表达，进而减少RA血管新生的，与文献报道相一致。

JAK-STAT是一条重要的介导细胞因子信号传导的通路，细胞因子能与靶细胞上相应的受体相结合，通过JAK-STAT通路将信号由细胞膜传至细胞质并最终传至细胞核，而发挥多种生物学效应［12］。RA滑膜组织中许多细胞因子的表达显著升高，在RA的发生发展过程中发挥重要作用，而其大多细胞因子通过JAK-STAT信号转导通路发挥作用，因此推测针对性阻断JAK-STAT通路将可能达到改善RA病理过程的目的［13］。JAK-STAT通路在CIA大鼠发病过程中处于激活状态，给予CIA大鼠JAKSTAT信号通路特异性阻断剂AG490后，可以抑制STAT1及STAT3的酪氨酸磷酸化，并呈现剂量依赖性，明显改善关节炎大鼠的临床过程及预后［14］。STAT3作为JAK-STAT信号转导途径的底物在介导RA滑膜细胞信号转导中发挥重要的作用。STAT3是一种能与靶基因调控区DNA结合的细胞质蛋白，既具有信号传导功能又有转录活化功能。Funamoto有研究证实STAT3蛋白在VEGF基因的转录调控中起着重要的作用。研究发现，VEGF启动子区上存在着STAT3的结合位点，STAT3蛋白通过该结合位点可以直接调节VEGF的表达，VEGF是STAT3的直接靶基因。当在细胞外信号刺激下，STAT3的酪氨酸基团被磷酸化而激活成p-STAT3并在SH2区形成同源或异源二聚体，随后p-STAT3蛋白二聚体迅速转位入核结合并诱导下游基因如VEGF等的异常高表达［15］。本研究检测大鼠关节滑膜组织中STAT3蛋白的表达情况，结果表明，CIA模型组大鼠关节滑膜组织中STAT3蛋白的表达显著增高，而与模型组相比，穿山龙总皂苷及其他治疗组均可以显著的抑制滑膜组织中STAT3蛋白的表达，其治疗效果与雷公藤阳性对照组、薯蓣皂苷元组、穿山龙水溶性皂苷片组相比较，差异无统计学意义，考虑如文献报道，穿山龙总皂苷通过对STAT3蛋白的抑制直接降低了VEGF的水平。

综上所述，穿山龙总皂苷可能是通过抑制NF-κB信号转导途径中NF-κB p65的DNA结合活性和JAK-STAT信号转导通路中重要底物STAT3蛋白的表达，直接下调VEGF的水平，从而起到抑制类风湿性关节炎血管新生的作用。另外，胞内信号转导通路是一个复杂的调节网络，各条通路存在各种交互联系，相互协同，相互制约，穿山龙总皂苷对类风湿性关节炎血管新生的抑制作用，可能还会通过其他的途径，有待于进一步研究。

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