盐酸巴马汀抑制聚甲基丙烯酸甲酯颗粒诱导骨溶解的实验研究

张少坤，梁庆威，王赫，佐井光一，阮原芳

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）

人工关节无菌性松动是影响人工关节使用寿命和远期疗效最重要的并发症［1，2］，磨损颗粒诱发假体周围组织细胞产生一系列生物学反应是导致假体周围骨溶解及假体无菌性松动的重要因素。磨损颗粒刺激假体周围的巨噬细胞、成骨细胞、成纤维细胞等产生多种细胞因子，形成破骨细胞性骨吸收，同时影响成骨细胞的分化及功能，抑制骨形成。药物在预防和治疗磨损颗粒引起的人工关节松动方面能起到积极的作用。盐酸巴马汀是从防己科植物黄藤的干燥藤茎中提取精制而得，其具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗肿瘤和较强的抗菌作用，最新研究发现，盐酸巴马汀对破骨细胞及其信号传导通路有抑制作用［3］。本实验通过小鼠颅骨模型模拟人工关节无菌性松动的生物学环境，观察盐酸巴马汀在体内抑制炎性反应、减轻溶骨反应的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料

1月龄昆明雄性小鼠40只，体质量20～25 g，购于中国医科大学动物科学部。聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）颗粒取自人工关节置换术中所用骨水泥（德国Link公司），由东北大学材料与冶金学院加工，平均粒径16.3 μm，90%颗粒的粒径小于31 μm。PMMA颗粒用70%乙醇冲洗3次后环氧乙烷消毒，经检测不含内毒素。将颗粒在PBS中稀释，浓度为10 mg/mL。盐酸巴马汀（产品号361615，分子量387.86）购自美国 Sigma-Aldrich公司，用PBS稀释浓度至1 mg/mL。抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（产品号387A-1KT），购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 实验分组及处理

40只小鼠随机分成4组，每组10只，称质量并标记，A组为空白组，B组为阳性对照组，C组为实验组，D组为阴性对照组。参照von Knoch等［4］的方法构建小鼠颅骨模型。用10%水合氯醛（3 mL/100 g）麻醉，麻醉成功后小鼠头部用碘附消毒，铺无菌巾，取小鼠颅顶矢状线切开皮肤及皮下组织，暴露1 cm2范围完整的骨膜，剥离骨膜，暴露颅骨。其中B、C组小鼠用微量注射器在骨膜下注入经超声分散器分散后的PMMA颗粒悬液0.3 mL，颗粒均匀分布于颅骨表面，A、D组在颅骨表面注入生理盐水0.3 mL，然后缝合伤口。小鼠麻醉苏醒后分笼饲养。术后第2日起，A、B组小鼠颅骨植入颗粒处每日局部注射PBS 0.1 mL，C、D组每日注射盐酸巴马汀溶液0.1 mL。2周后以过量麻醉方式处死实验小鼠。

1.3 观测指标

1.3.1 一般情况观察：观察各组小鼠存活以及术后切口愈合等情况。

1.3.2 大体观察：术后14 d处死全部小鼠，无菌条件下取出颅骨，大体观察颅骨片表面骨溶解和骨膜炎性反应情况。

1.3.3 骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）和骨矿物含量（bone mineral content，BMC）检测：小鼠处死后剥离小鼠颅骨，应用XR-36型双能X线骨密度仪，分辨率为1.0 mm×1.0 mm，速度为40 mm/s，测定离体颅骨的BMC和BMD。

1.3.4 骨溶解分析：将标本置于4%甲醛溶液中固定12 h，EDTA脱钙液中脱钙14 d，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后制备厚5 μm连续切片。取部分切片行HE染色，使用多功能显微镜（BX-51，日本OLYMPAS公司）观察颅骨片表面侵蚀及骨膜炎性反应情况。每个标本取5张不连续切片，利用Image Pro Plus 6.0图像分析系统检测炎性细胞个数。每张切片计数蓝色深染细胞核数目即为炎性细胞总数，取平均值。

1.3.5 破骨细胞分析：取部分切片按照TRAP染色试剂盒说明书进行染色，使用多功能显微镜观察骨溶解区域内破骨细胞。颅骨骨溶解区域内呈蓝色深染的多核细胞为TRAP阳性破骨细胞。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

所有动物术中、术后均无死亡，术后伤口愈合良好，无红肿、流脓。

2.2 大体观察

B组取出的颅骨表面由白色的炎性组织和颗粒沉积覆盖，清除表面炎性组织及颗粒后，可见骨表面凹凸不平，骨质溶解明显。C组颅骨表面可见少许白色炎性组织，清除炎性组织后颅骨表面未见明显改变。A、D组取出的颅骨表面无炎性组织，颅骨表面光滑，骨质完好。

2.3BMD及BMC检测

B组BMD、BMC与A组比较均降低（P<0.05）；注射PMMA颗粒的C组小鼠，在注射药物后BMD和BMC与B组比较显著升高（P<0.05），但低于A组（P<0.05）；D 组 BMD、BMC 高于 B、C 组（P<0.05），但和A组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.4 骨溶解分析

B组炎性细胞浸润明显，计数较其余3组明显增多（P<0.05），组织切片可见较多的骨吸收区域，骨性结构破坏较多；C组炎性细胞计数较B组明显减少（P<0.05），但较 A、D 组多（P<0.05）；A、D 组炎性细胞浸润不明显，颅骨表面未见骨吸收区域，骨质均匀致密，2组比较炎性细胞计数差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1、图 2。

表1 各组BM D、BM C及组织学检测结果Tab.1 The resul t s ofBM D，BM C and hi st ol ogi calobservat i on i n 4 groups Group n BMD（g/cm2） BMC（kg） No.of inflammatory cells No.of osteoclasts A 10 0.132±0.004 0.425±0.023 1 496±6512），3） 02），3）B 10 0.109±0.0051） 0.353±0.0291） 4 031±1 186 8.85±2.54 C 10 0.120±0.0061），2） 0.418±0.0331），2） 1 965±1 1102） 3.72±1.462）D 10 0.133±0.0052），3） 0.426±0.0252），3） 1 030±4802），3） 02），3）1）P<0.05 vs group A；2）P<0.05 vs group B；3）P<0.05 vs group C.

2.5 破骨细胞含量分析

B组TRAP阳性破骨细胞计数较其余3组增多（P<0.05）；C组TRAP阳性破骨细胞计数低于B组（P<0.05），但高于 A、D 组（P<0.05）；A、D 组可见骨质均匀，无TRAP阳性破骨细胞。见表1、图3。

3 讨论

目前，较多学者已经证实人工关节置换术后出现的假体周围无菌性松动与巨噬细胞吞噬磨损颗粒进而激活RANKL-RANK-OPG信号传导通路有着密切的联系。RANKL-RANK-OPG轴是影响破骨细胞分化、发育及调节其功能唯一的途径，该通路的激活使骨吸收加强、骨形成减少从而引起骨溶解［5］。RANKL、OPG表达于同一类型的细胞，二者的平衡是维持局部骨代谢平衡的关键［6］。研究发现，界膜内RANKL/RANK的含量明显高于骨性关节炎滑膜内的含量，而OPG的含量与正常及骨性关节炎滑膜内含量的差异无统计学意义，且OPGmRNA仅在界膜内的血管内皮细胞中少量表达。表明在松动假体周围组织内，RANKL-RANK-OPG系统的表达呈失衡状态［7］。研究发现，无菌松动假体周围发生骨溶解的部位一般都有大量含磨损颗粒的多核巨细胞存在，而RANKL/RANKmRNA也主要由这些巨噬细胞表达，表明RANKL/RANK增多与巨噬细胞吞噬磨损颗粒有关［8］。

目前，作用于上游细胞因子试图阻断炎症信号传导的相关研究很多，体外实验效果肯定。但在体内环境中，由于各种上游细胞因子间复杂的级联交互作用，干预因素的作用不明显。RANKL-RANKOPG信号通路位于炎症信号传导通路的下游，并且是激活破骨细胞的主要途径［9］。至今已有多项研究表明RANKL抗体可阻断RANKL-RANK-OPG信号通路，有效抑制破骨细胞的激活，减轻骨溶解［10］，从而治疗骨质疏松症［11］。本实验研究了RANKL抗体盐酸巴马汀能否在体内有效阻断磨损颗粒所致炎性反应的传导通路，抑制溶骨反应。

本实验选用小鼠颅骨模型，观察盐酸巴马汀抑制骨溶解作用。颅骨模型是一种经典的骨溶解模型［4］，小鼠颅骨表面积大，而且完全排除了机械力学因素方面的影响，从而可以最真实地模拟生物学因素对人工关节无菌性松动的影响。目前认为超高分子量聚乙烯颗粒在引起假体周围骨溶解的过程中起主要作用，同时金属颗粒和骨水泥颗粒也可以引起骨溶解，且三者之间的差异无统计学意义［12］。本实验采用人工关节置换术中所用的骨水泥，通过人工加工制成接近于无菌性松动假体周围的磨损颗粒，在植入小鼠颅骨表面后成功模拟出骨溶解模型。结果显示，B组与其他3组比较破骨细胞计数、骨溶解程度的差异均有统计学意义（P<0.05），这与文献报道一致，再次证明PMMA颗粒可以引起小鼠颅骨模型中破骨细胞的分化成熟。术后14 d取出标本，可以明显看到注射PMMA颗粒的B组和其他各组相比，小鼠颅骨表面炎性反应、骨溶解效应及破骨细胞数量的差异均有统计学意义（P<0.05），而注射盐酸巴马汀的C组小鼠颅骨表面炎性反应、骨溶解效应及BMD与B组相比得到好转，但是不如A、D组。这说明盐酸巴马汀可以在一定程度上抑制RANKLRANK-OPG信号传导通路，从而抑制破骨细胞活性。A、D组各项数据比较差异均无统计学意义（P>0.05），提示在不施加PMMA颗粒的情况下，盐酸巴马汀对骨组织没有明显的作用。细胞实验证实，盐酸巴马汀通过抑制成骨细胞中RANKL基因的表达来减弱破骨细胞的分化，发挥对破骨细胞的抑制作用，仅有成骨细胞或破骨细胞存在的情况下，盐酸巴马汀不能很好的发挥其阻断RANKL/RANK信号传导通路的作用［3］。正常骨组织中破骨细胞数量较少，散在分布在骨组织边缘。D组小鼠颅骨表面未注射PMMA颗粒，未能激活RANKL-RANK-OPG信号通路和破骨细胞，这就导致了盐酸巴马汀不能很好的发挥其对破骨细胞的抑制作用。所以从HE染色、TRAP染色、BMD和BMC测量结果来看，A、D组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。

综上所述，本实验通过用RANKL抑制剂盐酸巴马汀抑制PMMA颗粒诱导的小鼠颅骨模型中破骨细胞的分化成熟，证实RANKL-RANK-OPG信号转导系统参与了假体无菌性松动的过程。同时，我们也认为盐酸巴马汀对防治人工关节无菌性松动有一定的作用，为防治人工关节无菌性松动提供了新的思路和理论基础，可能成为防治人工关节假体松动的方法。但是盐酸巴马汀如何作用于RANKL、对破骨细胞形态是否有影响、其疗效和药物剂量之间是否有关系等一系列问题还有待进一步研究。

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