PIK3CB、Akt及p-Akt在子宫内膜癌中的表达及意义

张琛，杨清，王玉

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

子宫内膜癌作为发病率最高的女性盆腔生殖道恶性肿瘤之一，严重影响女性健康。许多信号转导途径与子宫内膜癌的发生、发展过程关系密切，其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号转导途径作为最主要的信号转导途径之一，在肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭中发挥着重要作用。本实验采用免疫组化方法及Western blot检测PIK3CB、Akt及p-Akt在子宫内膜癌组织中的表达情况，探讨子宫内膜癌的发病机制，为子宫内膜癌的诊治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

材料来源于中国医科大学附属盛京医院2005年1月至2007年12月妇科手术治疗的患者。免疫组化实验采用蜡块标本58例，其中增殖期子宫内膜6例，子宫内膜非典型增生7例，子宫内膜样腺癌45例；病理分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期10例；组织学分级：高分化（G1）15 例，中分化（G2）20 例，低分化（G3）10例。Western blot采用新鲜标本 30例，均为手术时取材，取材后立即送-70℃冰箱保存，其中增殖期子宫内膜6例，子宫内膜非典型增生6例，子宫内膜样腺癌18例。增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生及子宫内膜样腺癌均经病理学诊断证实，其中子宫内膜样腺癌根据世界卫生组织/国际妇产科联盟手术病理分期标准进行分期，患者术前均未接受过放疗、化疗或激素治疗。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测：PIK3CB抗体购于美国Abcam公司，Akt、p-Akt抗体及SP试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，SP免疫组化染色按试剂盒说明操作。免疫组化结果判定：PIK3CB、Akt及p-Akt阳性细胞染色均为棕黄色颗粒，定位于细胞质。采用MetaMorph/DP10/BX41显微图像分析系统分析结果。以积分光密度（integral optical density，IOD）代表蛋白颗粒密度。

1.2.2 Western blot检测：取40 μg总蛋白上样进行10%不连续SDS-PAGE电泳，通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转印至硝酸纤维素滤膜上，10%脱脂奶粉于室温封闭滤膜过夜，常规将转印后的膜依次与一抗和二抗孵育，最后以碱性磷酸酶法显色目的条带。Western blot结果判定：应用自动电泳凝胶成像分析仪（Alpha Innotech Corporation 5500型，美国Alpha Innotech公司）分析蛋白条带的强弱（以IOD表示）。

1.3统计学分析

2 结果

2.1 免疫组织化学检测结果

免疫组化结果显示PIK3CB、Akt及p-Akt均主要在胞质内表达，显微镜下表达阳性细胞可见胞质呈棕黄色（图1）。在增殖期子宫内膜组织中，PIK3CB、Akt及p-Akt呈弱阳性表达或阴性表达，在子宫内膜非典型增生组织及子宫内膜样腺癌组织中的表达明显增高（P<0.05），见表1。值得注意是，在不同临床病理分期和不同组织类型病理分级的子宫内膜样腺癌组织中PIK3CB表达量的差异无统计学意义（P>0.05）；在不同组织类型病理学分级的子宫内膜样腺癌组织中，Akt及p-Akt的表达量差异具有统计学意义（P<0.05），但与临床病理分期无关（P>0.05），见表 2。

表1 PI K3C B、Akt及p-Akt在不同子宫内膜组织中表达的I O D值Tab.1 I nt egralopt i caldensi t y val ues ofPI K3C B，Aktand p-Akti n di f f erentendom et ri alt i ssues Group n PIK3CB Akt p-Akt Normal proliferative-phase endometrium 6 1.51±0.84 10.57±2.45 15.60±1.65 Atypical endometrial hyperplasia 7 9.96±13.151） 15.06±3.151） 32.89±5.401）Endometrial carcinoma 45 27.81±15.421），2） 38.59±2.871），2） 66.51±6.981），2）1）P<0.05 vs normal proliferative-phase endometrium；2）P<0.05 vs atypical endometrial hyperplasia.

2.2 Western blot检测结果

Western blot定量分析 PIK3CB、Akt及 p-Akt的表达量，结果与免疫组化实验的结果一致，在不同类型的子宫内膜组织中PIK3CB、Akt及p-Akt蛋白的表达量差异具有统计学意义（P<0.05），由增殖期子宫内膜到子宫内膜非典型增生到子宫内膜样腺癌呈增强趋势。

表2 PI K3C B、Akt及p-Akt在不同组织学分级和病理分期子宫内膜样腺癌组织中表达的I O D值Tab.2 I nt egralopt i caldensi t y val ues ofPI K3C B，Aktand p-Akti n di f f erentt ypes ofendom et ri aladenocarci nom a t i ssues by hi st ol ogi calgrade and pat hol ogi calst age Item n PIK3CB Akt p-Akt Histological grade G1 15 25.28±4.98 29.52±4.25 7.33±2.37 G2 20 28.44±3.40 38.84±3.02 12.18±1.43 G3 10 30.36±2.78 51.70±8.22 25.67±2.80 Pathological stageⅠ21 25.63±2.36 34.90±2.88 9.28±2.86Ⅱ14 25.01±1.50 48.90±2.26 12.05±3.07Ⅲ10 36.44±2.30 50.27±8.40 17.48±1.95

3 讨论

PI3K/Akt信号转导通路与子宫内膜癌的发生发展密切相关，催化亚基PIK3CB作为Ⅰ型PI3K的重要组成部分，在肿瘤的形成和发展中发挥着重要作用：（1）抑制细胞凋亡，促进细胞增殖［1，2］。（2）介导细胞周期进展、促进细胞增殖：PIK3CB可以通过对周期素依赖性激酶的调节作用，促进细胞周期的运行。Cyclin E是属于G期细胞周期的正调节因子，PIK3CB的下调可以导致Cyclin E显著下降，从而影响细胞周期的进展［3］。（3）PIK3CB可以诱导致癌性转化：多项研究表明，PIK3CB的高表达有潜在的诱导致癌性转化作用［4，5］。这可能是因为PIK3CB过表达导致的PI3K/Akt信号转导途径的过度激活，促进肿瘤细胞的增殖。此外，PIK3CB不仅通过抑制细胞凋亡、促进细胞增殖而与肿瘤发生有关，还可影响肿瘤细胞的迁移、侵袭而促进肿瘤进展［6］。本研究发现，PIK3CB主要在细胞胞质表达，在子宫内膜样腺癌组织中的表达量明显高于增殖期子宫内膜组织和子宫内膜非典型增生组织（P<0.05），Western blot结果与免疫组化结果一致。由此可见，PIK3CB可能通过抑制子宫内膜细胞正常凋亡而在子宫内膜癌的发生、发展过程中发挥重要作用。Wee等［5］通过对前列腺癌PC3细胞系、人恶性胶质瘤U87MG细胞系的研究表明，抑制PIK3CB的表达可以有效的下调p-Akt的表达，抑制PC3细胞及U87MG细胞的增殖，并促进其细胞凋亡，降低了肿瘤细胞的恶性生物学行为，在抑制肿瘤的发生、发展中具有重要作用。在针对乳腺管癌［7，8］的研究中亦表明，敲除PIK3CB基因能有效地抑制了乳腺管癌细胞的增殖，促进其凋亡。进一步说明针对PIK3CB的干预治疗有可能成为抑制肿瘤增殖和存活的一个新的治疗方法，亦有可能成为子宫内膜癌治疗的一个新靶点。

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞增殖：（1）Akt的活化可受大量细胞因子、生长因子的触发，从而保护细胞免受凋亡。（2）过表达显性失活突变Akt基因可促进凋亡，而过表达组成性激活突变Akt基因可抑制凋亡。Akt参与了多种恶性肿瘤的发生、发展，在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及胃癌中都检测出了Akt的过表达［9］。有研究显示Akt在胃癌组织中呈高表达，提示Akt蛋白的高表达可能促进胃癌细胞的增殖，抑制其凋亡。我们发现Akt在子宫内膜样腺癌组织中亦呈高表达，表达量明显高于增殖期子宫内膜组织和子宫内膜非典型增生组织（P<0.05），提示Akt的过表达可能促使子宫内膜细胞逃避凋亡、异常增殖并促进子宫内膜癌的发生和发展。

p-Akt作为Akt的活化形式，在抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖和血管生成等方面发挥着重要作用。大量研究表明，在许多恶性肿瘤中p-Akt呈持续高度活化，而且p-Akt的异常表达与肿瘤的发生、发展以及对放化疗产生的耐受密切相关［10］。通过我们的研究证实p-Akt在子宫内膜样腺癌组织中的表达明显高于增殖期子宫内膜及子宫内膜非典型增生组织（P<0.05），表明Akt的磷酸化激活可能是促进子宫内膜癌细胞增殖、抑制其凋亡的重要原因。Aleskandarany等［11］对大宗病例的检测结果显示，76%的早期乳腺浸润性导管癌中p-Akt呈高表达。同样，对结直肠癌的研究提示p-Akt的表达与结直肠癌的TNM分期相关，推测p-Akt很可能在结直肠癌的生长和发展过程中发挥重要作用，其高表达促进淋巴结转移的发生。在本研究中还发现PIK3CB、Akt及p-Akt在子宫内膜样腺癌组织中的表达量均明显高于增殖期子宫内膜组织及子宫内膜非典型增生组织（P<0.05），由此推测在子宫内膜癌中，PIK3CB的过表达能够上调Akt及p-Akt的表达，促进子宫内膜癌细胞的增殖，抑制其凋亡，但三者之间的关系具体如何，还需进一步的研究证明。

综上所述，深入研究PI3K/Akt信号转导通路在子宫内膜癌发生、发展中的作用，不仅有利于阐明子宫内膜癌恶性增殖和存活的分子机制以及加深对PI3K/Akt信号转导通路的了解，还能为临床预测子宫内膜癌的发生、基因治疗和预后判断提供新的有效靶点。

［1］An HJ，Cho NH，Yang HS，et al.Targeted RNA interference of phosphatidylinositol 3-kinase p110-β induces apoptosis and proliferation arrest in endometrial carcinomar cells［J］.J Pathol，2007，212（2）：161-169.

［2］Jia S，Zhang S，Liu P，et al.Essential roles of PI（3）K-p110β in cell growth，metabolism and tumorigenesis［J］.Nature，2008，454（7205）：776-779.

［3］CiraoloE，IezziM，MaroneR，etal.Phosphoinositide3-kinase p110beta activity：key role in metabolism and mammary gland cancer but not development［J］.Sci Signal，2008，1（36）：ra3.

［4］Ono A，Ishizuka T，Matsuzaki S，et al.PI3K-p110beta positively regulateslipopolysaccharide-induced IL-12 production in human macrophages and dendritic cells and JNK1 play a novel role［J］.J Immunol，2009，182（9）：5225-5231.

［5］Wee S，Wiederschain D，Maira SM，et al.PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（35）：13057-13062.

［6］杨清，张淑兰，王玉.子宫内膜癌组织中p-PKB及仅含BH3域蛋白的表达及其相关性［J］.中国肿瘤临床，2006，33（16）：912-915.

［7］Hashem A，Dbouk，Jonathan M.A beta version of life：p110β takes center stage［J］.Oncotarget，2010，1（8）：729-733.

［8］Dou Z，Pan JA，Lin RZ，et al.The beta identity of class I Ptdlns3K a positive role of p110β in autophagy revealed［J］.Autophagy，2011，7（2）：246-247.

［9］黄宪章，赵学芹，李曼，等.Akt shRNA载体的构建及其对结肠癌细胞株Lovo Akt基因表达的抑制作用［J］.南方医科大学学报，2011，31（11）：1914-1917.

［10］周云英，刘华，郭锐翰，等.缺氧影响PTEN磷酸化和核定位［J］.首都医科大学学报，2011，32（2）：244-248.

［11］Aleskandarany MA，Rakha EA，Ahmed MA，et al.Clinicopathologic and molecular significance of phoshpho-Akt expression in early invasive breast cance［J］.Breast Cancer Res Treat，2010，127（2）：407-416.