人线粒体转录因子A的表达与前列腺癌细胞顺铂耐药性机制的研究

韩斌，白松，栾岚，吴斌

（1.中国医科大学附属盛京医院泌尿外科，沈阳 110004；2.沈阳医学院奉天医院病理科，沈阳 110024）

前列腺癌是一种依靠雄激素成长的恶性肿瘤。由于它对雄激素的依赖性（androgen dependent），临床上应用雄激素阻断疗法治疗初发前列腺癌都会有很好的疗效。然而，随着肿瘤细胞的变异与进展，很多病例变为雄激素非依赖型（androgen independent），雄激素阻断疗法失去疗效。而化学疗法包括紫杉醇，唑来磷酸，顺铂等药物对雄激素非依赖性前列腺癌的疗效却十分有限，探索雄激素非依赖性前列腺癌的耐药机制具有十分重要的现实意义。本文通过雄激素非依赖型前列腺癌细胞系PC3的研究，探讨TFAM的表达与顺铂耐药性的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

PC3细胞，及由PC3细胞培育成的顺铂高耐受性细胞PCDP6由日本产业医科大学分子生物学教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：应用5%CO2，37℃培养箱进行细胞培养，培养基含10%FBS，10 000 U/L青霉素和0.1 g/L链霉素。

1.2.2 siRNA干扰：应用TFAM siRNA#1与siRNA#2［1］转染 PC3 细胞。

1.2.3 Western blot：收集细胞后，提取细胞蛋白。应用SDS-PAGE电泳分离样品蛋白质条带，并应用湿转法把蛋白样品转移到NC膜上。NC膜经一抗、二抗孵育，洗膜后发光实验检测蛋白表达水平。

1.2.4 顺铂对PC3细胞IC50的测定：将siRNA转染干扰后的细胞悬液接种于96孔板，加入含不同浓度顺铂的培养液培养72 h。MTT法测IC50。应用χ2检验对比不同IC50，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐顺铂细胞高表达TFAM

相比于其母细胞系PC3，顺铂高耐受细胞PCDP6高表达TFAM与survivin（图1），而作为内参的β-actin无变化。

2.2 低表达TFAM的PC3细胞对顺铂敏感性增强

当用小干扰RNA成功降低PC3细胞TFAM表达后（图1），用不同浓度顺铂作用于细胞，绘制耐药曲线，计算IC50。我们观察到，TFAM表达降低后，PC3对顺铂敏感性增强，IC50明显下降，P<0.05（图2）。

2.3 TFAM可调控survivin的表达

转染特异性 siRNA#1，#2到 PC3细胞降低TFAM表达后，Western blot结果显示survivin的表达同样降低。而作为内参的β-actin无明显变化。

3 讨论

TFAM是体细胞内重要的调控线粒体活性的因子蛋白，当线粒体DNA受到损伤时，TFAM可以特异性的结合存在损伤或变异的线粒体DNA序列上，稳定DNA结构，阻止由DNA损伤引发的凋亡［2，3］。研究证实，TFAM的表达在PC3细胞生长中发挥重要作用，并抑制细胞的凋亡［1］。但TFAM的表达与PC3细胞对化疗药物敏感性间的关系未见报道。顺铂是烷化剂类的细胞毒性药物，可抑制癌细胞的DNA复制过程，较强的广谱抗癌作用。癌细胞内，线粒体DNA由于缺乏核小体等结构的保护，极易受到顺铂的攻击而损伤，从而诱导凋亡。而TFAM可特异性的结合在变异的线粒体DNA表面，起修复和保护的作用。这从理论机制上说明TFAM的表达可对抗顺铂的细胞毒性。本研究证实TFAM的表达与前列腺癌细胞的耐药性呈正相关。耐顺铂的PCDP6高表达TFAM。而成功降低TFAM表达后，PC3细胞对顺铂IC50明显下降。

最新的研究表明，降低survivin表达后，胃癌细胞对顺铂的敏感性增强［3］。survivin是广泛高表达在于肿瘤细胞中的蛋白，它在肿瘤细胞内发挥重要的作用，包括与前列腺癌的分期分级正相关［4］。本研究发现，在PCDP6中，survivin表达升高，survivin在癌细胞耐受顺铂中发挥作用。而TFAM的表达可以促进survivin的表达，当用小干扰RNA降低TFAM蛋白表达后，survivin的表达同样降低，TFAM与survivin的相关性说明TFAM也通过调控survivin参与对顺铂的耐药。TFAM通过多种通路参与雄激素非依赖性前列腺癌细胞中对顺铂的耐药机制，可以作为晚期前列腺癌的治疗靶点。

［1］Han B，Izumi H，Yasuniwa Y，et al.Human mitochondrial transcription factor A functions in both nuclei and mitochondria and regulates cancer cell growth［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，29408（1）：45-51.

［2］Kang D，Kim SH，Hamasaki N.Mitochondrial transcription factor A（TFAM）：roles in maintenance of mtDNA and cellular functions［J］.Mitochondrion，2007，7（1-2）：39-44.

［3］Shen X，Zheng JY，Shi H，et al.Survivin knockdown enhance gastric cancer cell sensitivity to radiation and chemotherapy in vitro and in nude mice［J］.Am J Med Sci，2012 Jan 18［Epub ahead of print］.

［4］于洪波，韩小兵，梁宜骞，等.OPN及survivin在前列腺癌组织中的表达及临床意义［J］.南方医科大学学报，2010，30（5），1141-1143.