山仙颗粒对H22移植瘤小鼠TGF－α和端粒酶表达影响的实验研究＊

方 瑜 李仁廷 陈光伟 陕西中医学院（咸阳 712046）

原发性肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，严重威胁人民群众的生命及健康。我国是原发性肝癌的高发地区，据最新估计，2008年全球新增肝癌患者约74.8万，其中我国40.2万（54%）［1，2］。其起病隐匿、病程较短、来势凶险、侵袭性强、死亡率较高（20.4／10万），已成为一个极其严重的国际卫生问题［3］。本实验通过建立H22腹水型瘤株移植瘤小鼠模型，研究山仙颗粒对肝癌小鼠的癌细胞生长的影响和可能的作用机制，通过对TGF－α和端粒酶的表达来分析，从而为山仙颗粒在临床上的应用提供实验依据。

1 材 料 1.1 肝癌移植型瘤株 H22腹水型肝癌瘤株，（由第四军医大学实验动物中心提供），昆明小鼠腹腔内传代7d。合格证号：SCXK（军2011－005）。

1.2 实验动物 选用健康雌性KM小鼠85只，体重18～22g，月龄1～1.5月。（由西安交通大学医学院实验动物中心提供），动物合格证号：SCXK（陕2007－001）。

1.3 实验用药 山仙颗粒（SXG）：（陕中附院制剂研究中心，批号：20110527，组方：西洋参30g，延胡索24g，莪术、仙鹤草、山楂各15g，龟版、鳖甲、猪苓各12g，），SXG按小鼠5g／kg（相当于临床用量）用生理盐水配置成0.5g／mL混悬液。阳性对照药替加氟（50mg／片，生产批号：20110305）研磨，按成人用量1000mg／d（成人体重60kg）计算，加入蒸馏水0.3mL，则浓度为1000mg÷60kg×9.01×0.02kg÷0.2mL＝15mg／mL。

1.4 试剂 兔抗小鼠TGF－α单克隆抗体（一抗），产品编号：bs－0066R，0.1mL；TRT／TERT 端粒酶反转录酶抗体，产品编号：bs－0233R，0.2mL；羊抗兔多克隆抗体（二抗），DAB显色剂，型号：C－0003；均购于北京博奥森生物科技有限公司；SP免疫组化试剂盒，型号：SP－9002；购于北京中杉金桥生物技术有限公司。4%多聚甲醛、0.1mmol／L PBS缓冲液由陕西中医学院中心实验配置。

2 方 法 2.1 动物实验方法 在无菌的工作台上，抽取接种7d的H22瘤株的小鼠腹水，离心后选用底层较浓稠的腹水液，借助于0.02%伊红稀释染色，计算活肿瘤细胞数（未被染为红色的为活肿瘤细胞），用生理盐水稀释成1×107／mL的瘤细胞悬液，将85只健康小鼠随机抽取15只作为空白组，A组：空白组；其余70只共同造模，将造模成功的小鼠纳入60只，随机分为4组，每组15只。B组：荷瘤对照组；C组：替加氟组；D组：山仙颗粒组；E组：山仙颗粒＋替加氟组。将瘤细胞悬液按0.25mL／只在小鼠右腋皮下接种造模，共70只，以小鼠右腋下出现组织肿块为接种成功，63只小鼠出现组织肿块，接种成功率为90%。去除3只，将剩余小鼠随机分为4组，每组15只进行给药。A组：（0.9% 生理盐水，0.2mL／只）灌胃；B组（0.9% 生理盐水，0.2mL／只）灌胃；C组（15mg／mL替加氟稀释液，0.2mL／只）灌胃；D 组（0.5g／mLSXG，0.2mL／只）灌胃；E组（浓度为1g／mLSXG，0.1mL，浓度为30mg／mL替加氟溶液0.1mL／只）灌胃；各组小鼠每日灌胃1次，连用药14d，E组第1天及第7天采用两药共同灌胃，其他时间采用D组用药方法，用药14d。小鼠于用药后第15天脱臼处死。

2.2 计算抑瘤率和胸腺、脾脏指数 在干净工作台上，剥离瘤体及其周围组织，用滤纸吸干水分后，称瘤重，自来水冲洗，并将其固定于10%的甲醛中，随后摘除小鼠胸腺、脾脏，称重后计算抑瘤率及脏器指数。其公式分别如下：抑瘤率＝（荷瘤组平均瘤重－实验组平均瘤重）／荷瘤组平均瘤重×100%；脏器指数＝脏器的重量mg／小鼠的体重g。

2.3 免疫组化法测定TGF－α和端粒酶反转录酶活性的表达 将肿瘤组织常规病理取材，石蜡包埋，5um连续切片，二甲苯脱蜡；染色程序按免疫组化SP法常规进行。TGF－α阳性反应产物为棕色颗粒样，主要定位于细胞浆或（和）细胞核。端粒酶反转录酶TERT所表现出的颜色是棕褐色或者棕黄色散在分布的颗粒，其位置在细胞浆里。将免疫组化结果经图像分析软件处理，用400倍光学显微镜观察，每例随机观察5个视野，不少于100个细胞，计算阳性细胞数。阳性表达率＝表达阳性细胞数／总细胞数×100%。

3 结 果 3.1 各组药物对小鼠H22肝癌实体瘤的抑制作用 见表1。

表1 各组药物对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用

3.2 各组药物对荷瘤小鼠免疫功能的影响 见表2。

表2 各组药物对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响

3.3 各组小鼠癌组织中TGF－α和端粒酶的表达情况见表3。

表3 各组药物对H22荷瘤小鼠移植瘤TGF－α和端粒酶表达的结果

荷瘤组肝癌组织TGF－α（×400）替加氟组肝癌组织TGF－α（×400）SXG组肝癌组织TGF－α（×400）联合用药组肝癌组织TGF－α（×400）

荷瘤对照组 端粒酶（×400） 替加氟组 端粒酶（×400） SXG组 端粒酶 （×400）联合用药组 端粒酶 （×400）

4 讨 论 转化生长因子α与表皮生长因子受体（EGFR）结合级联激活 MAPK 信号系统（Raf－MEK－ERK）［4］，促使DNA合成从而使细胞增殖、分化，使肿瘤细胞的生长不受机体控制，致细胞增殖失控，从而形成癌变。研究发现［5］，TGF－α表达明显与肝癌细胞的凋亡呈负相关，TGF－α表达减弱可以加速肝癌癌细胞的凋亡，而TGF－α表达增强则会抑制肝癌癌细胞的凋亡进程。随着肝癌病变进展，TGF－α阳性肝细胞数逐渐增多，TGF－α反 应明显增强，血清 TGF－α水平增加［6、7］。本 实 验显示，在小鼠肝癌组织中，用药组TGF－α蛋白的表达均降低（P＜0.05），其中联合用药组最为明显（P＜0.01）。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，在胚性细胞等复制活跃的细胞中具有活性，在正常发育完整的体细胞中端粒酶却失去了原本的活性，并且在绝大部分癌细胞中都表现出端粒酶为（＋），但是在癌旁组织、正常组织，阳性的概率却不高，可以认为端粒酶应该是肿瘤的特异性标志物。端粒酶的活性根据原发性肝癌发生和发展，表现出逐渐增多的反应。激发端粒酶也许是导致原发性肝肿瘤进一步发生、发展的继发性变化［8］，本实验显示，荷瘤组小鼠端粒酶反转录酶活性过度表达，显著高于各用药组 （P＜0.01），说明用药物可以抑制肝癌细胞端粒酶的表达，其中以联合用药组最为明显（P＜0.01）。SXG组和替加氟组都有抗肿瘤生的作用（P＜0.01），但对小鼠免疫功能的影响之间有着显著的差异（P＜0.01）。说明山仙颗粒在抑制肿瘤生长的同时，也能够改善小鼠的一般状况，提高小鼠的生活质量和保护免疫器官功能；西药替加氟在杀伤机体肿瘤细胞的同时，对正常的组织细胞和机体的免疫功能也有明显的损伤。联合用药组在抑瘤率和减少TGF－α和端粒酶表达方面优于单纯用药组，说明联合用药具有减毒增效的作用。肝癌的发病是因虚致病，因病致虚，气虚毒瘀为其基本病理状态，山仙颗粒是陕西省名中医陈光伟的经验方，以“扶正祛邪”为总则，由西洋参、莪术、龟版、鳖甲、延胡索、仙鹤草、猪苓、山楂等药组成，通过本次实验说明该中药抗肝癌的机理可能与降低TGF－α和端粒酶的表达及提高小鼠免疫功能有关。

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