三黄散瘀巴布剂中大黄与黄芩的提取工艺研究

尹 华， 章建华， 许丛辉， 刘云飞， 王 玲

(1.浙江中医药大学药学院中药标准化研究实验室，浙江杭州 310053;2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江杭州 310006)

三黄散瘀巴布剂由大黄、黄芩和黄柏等药味组成，具有活血祛瘀、行气止痛、消肿散结的作用，可用于治疗软组织损伤。现代研究表明，大黄具有抗肿胀、抗菌消炎和免疫作用，其活性成分为芦荟大黄素、大黄酸等蒽醌类成分［1-2］;黄芩具有消炎作用，其主要活性成分为黄芩苷［3］等黄酮类成分。透皮吸收试验发现，大黄中游离蒽醌与结合蒽醌、黄芩中的黄芩苷均可以透过皮肤角质层，产生药效，因此，本实验选用上述成分的转移率作为评价指标进行制备工艺的考察，对方中各药味均建立了评价指标，可全面客观反映制备工艺各因素的影响。

根据课题组前期实验研究，已知大黄与黄芩合提，黄柏单独提取更有利于药效成分的提出 (相关数据整理成文待发表)，故本试验采取大黄、黄芩合提，黄柏单提的方法。以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和黄芩苷等多个指标的转移率为评价指标，结合综合加权评分法筛选优化提取工艺。

1 材料、仪器及试剂

1.1仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪 (美国安捷伦);Sartorius BD211D十万分之一电子天平 (德国塞多利斯);Sartorius BS110S万分之一电子天平 (德国塞多利斯);CLAUVFM纯水机 (英国 ELGA);旋转蒸发仪 (上海申生);KQ5200B型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。

1.2材料与试剂 芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品、黄芩苷对照品 (中国药品生物制品检定所，供定量测定用，批号分别为:110795-200605、0757-200206、0756-200211、110796-200310、110758-2-509、110715-200514);大黄 (20091030，20070822，20070727，甘肃 掌叶大黄)、黄芩 (20091030，20071003，20070119，内蒙古)分别购自华东医药有限公司和浙江中医药大学中药饮片厂，经浙江中医药大学药学院张如松教授鉴定为正品，符合2005年版《中国药典》(一部)规定;甲醇 (色谱纯，美国TEDIA公司);水为过0.2 μm滤膜的纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

结合处方中各药味的理化性质［1-4］:黄柏中的主要有效成分盐酸小檗碱为季铵盐，大黄中蒽醌类成分和黄芩中有效成分黄芩苷都呈酸性，可以与盐酸小檗碱形成盐，沉淀析出，所以若将三者合提会降低有效成分转移率，因此黄柏适合单独提取，大黄中的蒽醌类成分与黄芩中黄芩苷结构相似适合合提，本试验前期对各药味的配伍提取方式进行考察，大黄、黄芩、黄柏单提、两两合提、三药合提;结果表明大黄和黄芩合提，黄柏单独提取时，各指标成分的转移率均较高，提取率亦均高于其它配伍提取方式 (相关数据整理成文待发表)。故而确定大黄和黄芩合提，黄柏单提。以君药大黄中蒽醌类成分和臣药黄芩中黄芩苷的转移率作为评价指标，采用多指标综合加权评分法 (芦荟大黄素∶大黄酸 ∶大黄素 ∶大黄酚 ∶大黄素甲醚 ∶黄芩苷的权重系数为0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.4)，对各工艺参数进行考察，优化提取工艺，并对最佳工艺进行验证试验。

2.1 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的测定［5-6］

2.1.1 色谱条件 Agilent 1200高效液相色谱仪 (DAD);Zorbax Eclipse SB-C18色谱柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱 (见表1);检测波长254 nm;体积流量1.0 mg/mL;柱温25℃;进样量10 μL，理论塔板数以大黄素峰计不低于3 000。

表1 梯度洗脱程序

2.1.2 标准曲线的制备 取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇配成质量浓度分别为0.214 5、0.156 8、0.187 7、0.374 0、0.110 5 mg/mL的混合对照品贮备液。精密吸取上述混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按2.1.1项下色谱条件分别进样10 μL，测定。以质量浓度X(mg/mL)分别对峰面积Y进行线性回归，得芦荟大黄素回归方程为:Y=34.95X+0.769 6(r=0.999 4)，线性范围为2.145～21.45 mg/mL;大黄酸回归方程为:Y=36.88X-8.289(r=0.999 8)，线性范围为1.568～15.68 mg/mL;大黄素回归方程为:Y=32.49X-0.412 0(r=0.999 4)，线性范围为1.877～18.77 mg/mL;大黄酚回归方程为:Y=39.31X-8.20(r=0.999 7)，线性范围为3.740～37.40 mg/mL;大黄素甲醚回归方程为:Y=17.37X-3.438(r=0.999 5)，线性范围为1.105～8.842 mg/mL。

2.1.3 加样回收试验 精密吸取已知含有量的提取液0.5 mL，分别精密加入芦荟大黄素对照品溶液 (0.107 2 mg/mL)0.10 mL，大黄酸对照品溶液 (0.078 4 mg/mL)0.11 mL，大黄素对照品溶液 (0.093 8 mg/mL)0.08 mL，大黄酚对照品溶液 (0.187 0 mg/mL)0.11 mL，大黄素甲醚对照品溶液 (0.055 2 mg/mL)0.12 mL，按2.1.4项样品测定项下供试液的制备方法平行制备6份，按2.1.1项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果表明芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率分别为100.3%(RSD为2.2%，n=6)、101.3%(RSD为2.5%，n=6)、100.5%(RSD为2.2%，n=6)、100.8%(RSD为1.5%，n=6)、98.48%(RSD为2.9%，n=6)，均符合要求。

2.1.4 样品测定 精密吸取各工艺提取液1.0 mL，每批平行取2份，加8%盐酸溶液10 mL，三氯甲烷10 mL，水浴加热回流1.0 h，放冷，转移至分液漏斗中，静置、分层，取三氯甲烷层，水层再用三氯甲烷萃取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷层，回收三氯甲烷，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，过膜即得，按2.1.1项下色谱条件进样10 μL测定。与同批药材比较，计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含有量及转移率。色谱图见图1。

图1 对照品 (A)和提取液 (B)HPLC色谱图

2.2 黄芩苷测定［4，7］

2.2.1 色谱条件 Agilent 1200高效液相色谱仪 (DAD);Zorbax Eclipse SB-C18色谱柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.2%磷酸，梯度洗脱见表2;检测波长280 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温25℃;进样量10 μL，理论塔板数以黄芩苷峰计不低于2 500。

表2 梯度洗脱程序

2.2.2 标准曲线的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇配成1.130 mg/mL的黄芩苷对照品贮备液;精密吸取此贮备液1.0 mL，加甲醇定容至10 mL，摇匀，配成0.113 0 mg/mL的黄芩苷对照品溶液;精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。按2.2.1项色谱条件进样10 μL，测定。以黄芩苷的质量浓度X(mg/mL)对峰面积Y进行线性回归，得回归方程为:Y=31.00X-32.65(r=0.999 8)，表明黄芩苷在5.60～90.40 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.3 加样回收试验 精密吸取已知含有量的提取液0.5 mL，精密加入黄芩苷对照品溶液 (1.130 mg/mL)0.8 mL，按2.2.4项下供试品溶液的制备方法平行制备6份，按2.2.1项色谱条件进样10 μL，测定，计算加样回收率。结果表明黄芩苷的平均回收率为102.1%(RSD为1.7%，n=6)，符合要求。

2.2.4 样品测定 精密吸取各药液1.0 mL，每批平行2份，用流动相溶解并定容至10 mL，再精密吸取1.0 mL加流动相定容至10 mL，摇匀，过膜即得，进样10 μL测定，与同批饮片比较，计算提取液中黄芩苷的含有量及转移率。色谱图见图2。

2.3 单因素试验

2.3.1 提取方法的考察 取大黄、黄芩饮片3份，每份各为25 g，加8倍量60%乙醇，分别采用冷浸 (浸泡24 h)、超声 (2次，每次60 min)、回流 (2次，每次1.5 h)法进行提取，将各醇提液回收乙醇并浓缩至0.05 g(总生药量)/mL，测定各提取液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和黄芩苷的含有量，计算其转移率，结果见表3，回流提取效率明显优于冷浸法和超声法，故选择回流提取法。

图2 对照品 (A)和提取液 (B)HPLC色谱图

表3 提取方法考察结果(n=2)

2.3.2 提取溶剂的考察 根据处方中各药味所含有效成分的理化性质，考察水和60%乙醇两种提取溶剂。取大黄、黄芩饮片3份，每份各为25 g，加8倍量水或60%乙醇溶液，回流提取2次，每次1.5 h，提取液减压浓缩至0.05 g(总生药量)/mL，测定提取液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩苷的含有量，并计算转移率，结果见表4。由表可知，60%乙醇溶液回流的提取效率优于水提取，故确定以60%乙醇作为提取溶剂。

表4 提取溶剂考察结果(n=2)

2.3.3 溶剂用量的考察 取大黄、黄芩饮片3份，每份各为25 g，分别加8、10、12倍量60%乙醇溶液，回流提取1.0 h，提取2次，提取液减压浓缩至0.05 g(总生药量)/mL，测定提取液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩苷的含有量并计算转移率，结果见表5。结果表明，随溶剂用量增加，提取效率增高，但10倍与12倍量溶剂并无显著差异，从成本及能耗角度考虑，确定用10倍量溶剂。

表5 溶剂用量考察结果 (n=2)

2.4 正交试验 称取大黄、黄芩饮片9份，每份各25 g，以10倍量60%乙醇溶液回流提取，采用L9(34)正交试验法［1-2］，考察回流时间、含乙醇量和提取次数等因素对芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和黄芩苷转移率的影响，提取液中5种蒽醌类成分和黄芩苷的转移率的测定结果见表6，以多指标综合加权评分法 (芦荟大黄素∶大黄酸∶大黄素 ∶大黄酚 ∶大黄素甲醚 ∶黄芩苷的权重系数为0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.4)评价，实验结果的直观分析和方差分析见表6、表7。

直观分析显示:各因素作用主次为A(提取次数)＞B(回流时间)＞C(含乙醇量);方差分析显示:因素A(提取次数)、B(回流时间)的影响有显著性差异，因素C(含乙醇量)的影响无显著性差异，则两者的较佳提取工艺为:A3B3C2，即加10倍量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5 h。选择A3B3C2作为方案进行验证试验。

表6 大黄与黄芩合提工艺L9(34)正交试验结果

表7 方差分析

2.5 验证试验 称取大黄、黄芩饮片3份，每份各25 g，按优化的提取工艺 (10倍量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5 h)提取，测定提取液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩苷的含有量及转移率，验证最佳提取工艺的合理性，3份提取工艺的验证试验结果见表8，各成分提取均较完全，且重复性较好，表明正交试验得到的提取工艺切实可行。

表8 大黄与黄芩合提工艺验证试验结果(n=3)

3 讨论

3.1 提取工艺的考察［1-3］根据处方中各药味中有效成分的理化性质，黄柏中主要有效成分盐酸小檗碱为季铵盐，大黄中蒽醌类成分和黄芩中黄芩苷均呈酸性，三者合提易形成盐，沉淀析出，会降低有效成分的转移率。因此进行了各药味配伍提取方式考察 (大黄、黄芩、黄柏单提、两两合提、三药合提)，以各成分转移率和提取率为指标，结果表明大黄、黄芩合提，黄柏单提较优，故最终确定以大黄、黄芩合提，黄柏单提为提取工艺。

3.2 评价指标的选择及权重系数的确定 中药各成分多且复杂，而复方由多味中药组成，其成分也就更为复杂，因此在进行制备工艺考察时，评价指标的确定尤为关键。本试验采用了多味药有效成分 (指标成分)的转移率作为评价指标，结合综合加权评分法，进行工艺优化。考虑到大黄为君药，起主要作用，黄芩为臣药，且结合组方的量，大黄与黄芩合提工艺的正交试验采用多指标综合加权评分法评价，确定芦荟大黄素 ∶大黄酸 ∶大黄素 ∶大黄酚 ∶大黄素甲醚;黄芩苷转移率的权重系数为0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.4，既反映大黄君药的作用，又体现君、臣药的作用强度，与中医药理论相符合。

4 结论

本实验采用单因素和正交试验法，测定方中君、臣药的有效成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩苷的转移率，借助多指标综合加权评分法，优化三黄散瘀巴布剂中大黄与黄芩合提的提取工艺。所优选的工艺合理可行稳定，且重现性好，有效成分能较好地被提取出来;另一方面，本实验对方中的两味药建立了综合评价指标，较传统的以单一化学成分的转移率或浸膏得率来衡量制备工艺更为全面合理。

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