左归丸含药血清通过JNK信号通路诱导MC3T3成骨细胞分化的研究

刘立萍， 任艳玲*， 李 然， 王智民， 蒿长英， 宋 囡

(1.辽宁中医药大学 基础医学院，辽宁 沈阳 110847;2.辽宁中医药大学 第一临床学院，辽宁 沈阳 110847)

绝经后妇女易患骨质疏松症，对于绝经后骨质疏松症的防治日益受到人们的关注，现代研究表明中医药在绝经后骨质疏松症的药物治疗方面取得了不少成果，中医药临床治疗以“补肾”为法，能提高骨量，缓解或消除症状，并起到综合治疗目的［1］。中成药左归丸具有滋肾补阴功效，本课题组前期研究结果表明左归丸对去卵巢所致绝经后骨质疏松症大鼠有一定的防治作用［2］，为了进一步探讨左归丸治疗绝经后骨质疏松症的作用机制，本实验探讨JNK信号通路对左归丸含药血清调控MC3T3成骨细胞分化的影响。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠60只，(200±20)g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号:SCXK(沪)2008-0016。

1.2 细胞培养 MC3T3-E1 Subclone 14，由中国科学院上海生命科学研究院提供。MC3T3成骨细胞用含10%FBS的α-MEM培养液培养，每周换2次培养液，37℃、5%CO2培养箱内孵育。

1.3 药物与试剂 左归丸 (上海雷允上封浜制药有限公司，国药准字Z31020371);倍美力结合雌激素片 (爱尔兰惠氏药厂，国药准字J20050120);SP600125(Sigma);PNPP(Sigma);茜素红(Sigma);抗ALP抗体 (博士德);抗GAPDH抗体(北京中杉)。

1.4 主要仪器 iMark型酶标仪 (Bio-Rad);Trans-Blot SD半干转印系统 (Bio-Rad);EC3凝胶成像仪 (UVP)。

2 方法

2.1 含药血清的制备 大鼠按体质量随机分为3组，空白对照组、左归丸组、倍美力组，20只/组。根据人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠左归丸的等临床剂量为1.6 g/kg体质量，倍美力为56.25 μg/kg。药物灌服10 mL/kg，空白对照组灌服蒸馏水，2次/d，于第8天给药2 h后，腹主动脉取血，离心取上清，56℃灭活30 min。

2.2 细胞实验分组 依据不含或含JNK特异抑制剂SP600125(10 μmol/L)，将实验分为空白对照组、SP600125组、左归丸组、左归丸加SP600125组、倍美力组、倍美力加SP600125组。

2.3 细胞抑制剂预处理及给药 细胞接种24 h后，换用含0.2%FBS的α-MEM培养液饥饿24 h，弃培养液，加入不含或含10 μmol/L SP600125的α-MEM培养液预处理60 min后，各组加入终浓度为15%的相应含药血清孵育。

2.4 碱性磷酸酶活性测定 细胞以1×105接种于48孔培养板，抑制剂预处理及给药，孵育48 h后，0.1%Triton X-100裂解液4℃作用过夜，反复冻融3次，冰水浴内超声，收集裂解液。BCA法测定蛋白浓度，采用PNPP法测定ALP活性，测定孔内加入基质溶液 (2 mol/L二乙醇胺缓冲液，PNPP)，37℃孵育15 min，加入0.5 mol/L NaOH终止反应，酶标仪上415 nm测定吸光度 (A)。

2.5 改良钙钴法染色 细胞以1×105接种于24孔板，抑制剂预处理及给药，孵育7 d，每3天换1次液。95%乙醇固定10 min，PBS洗，加入孵育液 (2%氯化钙20 mL、2%巴比妥钠10 mL、3%β-甘油磷酸钠10 mL、5%硫酸镁5 mL、蒸馏水 5 mL)，37℃ 孵育4 h，去离子水冲洗，2%硝酸钴溶液5 min，去离子水冲洗，1%硫化铵溶液1 min，去离子水冲洗。

2.6 茜素红染色 细胞以1×105接种于24孔板，抑制剂预处理及给药，孵育14 d，每3天换1次液。95%乙醇固定10 min，PBS洗，0.1%茜素红-Tris-Hcl(pH8.3)，37℃，避光孵育30 min，去离子水冲洗。

2.7 Western blot分析 细胞以2×106接种于25 cm2培养瓶，抑制剂预处理及给药，孵育48 h。提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度，提取液中加入5×SDS上样缓冲液，100℃变性5 min，蛋白上样60 μg/孔，12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜3 h，5%脱脂奶粉封闭1 h。一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育2 h，ECL发光。实验结果采用quantity one软件分析，扫描光密度值。

2.8 统计分析 计量数据采用SPSS 10.0软件处理，用One-Way ANOVA进行分析，数据以表示。

3 结果

3.1 JNK抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3细胞48 h ALP活性的影响 由图1可见，与对照组比较，左归丸组和倍美力组均显著增强MC3T3细胞ALP活性 (P＜0.01);与左归丸组比较，左归丸加SP600125组对孵育48 h的ALP活性影响不显著，左归丸组优于倍美力组 (P＜0.05);与倍美力组比较，倍美力加SP600125组显著对抗倍美力含药血清对ALP活性的诱导 (P＜0.01)。

图1 JNK抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3细胞48 h ALP活性的影响(±s，n=5)Fig.1 Effects of inhibitor of JNK on Zuogui Pill-induced ALP activity within 48 h in MC3T3 cells(±s，n=5)

3.2 JNK抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3细胞7 d ALP活性的影响 由图2可见，与对照组比较，左归丸组和倍美力组均显著增强MC3T3细胞ALP活性 (P＜0.01);与左归丸组比较，左归丸加SP600125组对孵育7 d的ALP活性诱导明显减弱 (P＜0.01)，且左归丸组优于倍美力组 (P＜0.05);与倍美力组比较，倍美力加SP600125组显著对抗倍美力含药血清对ALP活性的诱导 (P＜0.01)。

3.3 JNK抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3细胞14 d矿化作用的影响 由图3可见，与对照组比较，左归丸组和倍美力组均显著增强MC3T3细胞矿化作用 (P＜0.01);与左归丸组比较，左归丸加SP600125组对孵育14 d的矿化作用诱导明显减弱 (P＜0.01)，且左归丸组优于倍美力组 (P＜0.05);与倍美力组比较，倍美力加SP600125组显著对抗倍美力含药血清对矿化作用的诱导 (P＜0.01)。

图2 JNK抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3细胞7 d ALP活性的影响(±s，n=3)Fig.2 Effects of inhibitor of JNK on Zuogui Pills-induced ALP activity within 7 d in MC3T3 cells(±s，n=3)

图3 JNK抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3细胞14 d矿化作用的影响(±s，n=3)Fig.3 Effects of inhibitor of JNK on Zuogui Pills-induced mineralization within 14 d in MC3T3 cells(±s，n=3)

3.4 JNK抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3细胞ALP蛋白表达的影响 由图4可见，与对照组比较，左归丸组和倍美力组均显著上调MC3T3细胞ALP蛋白的表达水平 (P＜0.01);与左归丸组比较，左归丸加SP600125组对孵育48 h的ALP蛋白表达的影响不显著，左归丸组优于倍美力组 (P＜0.01);与倍美力组比较，倍美力加SP600125组显著对抗倍美力含药血清对ALP蛋白表达的上调作用 (P＜0.01)。

图4 JNK抑制剂对左归丸含药血清干预MC3T3细胞ALP蛋白表达的影响(±s，n=3)Fig.4 Effect of of inhibitor of JNK on Zuogui Pills-induced expression of ALP protein in MC3T3 cells(±s，n=3)

4 讨论

绝经后骨质疏松症是以绝经后妇女骨量减少，易发生骨折为主要特征的病症，治以补肾、健脾等法，多选用补益剂，尤以入肾经最多［3］。具有补肾作用的中成药发挥防治骨质疏松作用［4］，滋补肾阴对肾阴虚型绝经后骨质疏松症治疗效果确切［5］，左归丸(《景岳全书》)为滋阴补肾之常用方剂，现代研究表明左归丸能够有效防治绝经后骨质疏松症［6-7］。

成骨细胞分化是骨形成的重要部分，其特异性标志有ALP表达，Ⅰ型胶原积累，骨钙素产生，骨基质矿化。骨形成时成骨细胞可分泌大量ALP，ALP活性可以反映成骨细胞的活跃状况［8］，骨矿化阶段主要是钙和磷酸盐合成［9］。本研究实验结果提示左归丸含药血清既能显著诱导MC3T3细胞分化前期的ALP活性，上调ALP蛋白表达水平，又能刺激成骨细胞分化末期的矿化结节形成，促进MC3T3成骨细胞分化。

促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号通路对于MC3T3成骨细胞连续分化起着重要作用，成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)诱导JNK蛋白磷酸化［10］，活化JNK参与BMP-2诱导的骨基质矿化［11］，SP600125阻 滞 JNK 通 路，显 著 抑 制MC3T3成骨细胞分化末期矿化作用，对成骨细胞分化早期阶段ALP活性表达影响不显著［12］。本实验研究结果表明SP600125阻滞JNK通路，对左归丸含药血清孵育48 h诱导的MC3T3成骨细胞分化前期的ALP活性和ALP蛋白表达的影响不显著，对孵育7 d的ALP活性和14 d的矿化结节的影响显著。结果提示左归丸含药血清诱导MC3T3成骨细胞分化末期尤其依赖JNK通路促进骨形成，这可能是左归丸防治绝经后骨质疏松症的机制之一，对于左归丸含药血清诱导MC3T3成骨细胞分化前期ALP活性是否主要通过p38或ERK通路值得进一步研究。

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