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黄芪葛根汤对糖尿病心肌病大鼠氧化应激和NF-κB表达的影响

2012-09-06陈艳芬王春怡李卫民唐春萍杨超燕薛秀敏

中成药 2012年8期
关键词:葛根心肌病黄芪

陈艳芬, 王春怡, 李卫民, 高 英*, 唐春萍, 杨超燕, 薛秀敏

(1.广东药学院中药学院,广东广州 510006;2.广州中医药大学中药学院,广东广州 510006)

糖尿病并发症发病的统一机制学说认为,在持续高糖状态下,线粒体活性氧簇 (ROS)生成增加可能是糖尿病各种并发症发生的中心环节,氧自由基生成增多导致的氧化应激既是糖尿病微血管病变发生、发展的重要影响因素,也是导致心肌损伤的重要因素[1]。因此针对糖尿病抗氧化治疗的临床与动物研究成为糖尿病及其慢性并发症预防与治疗用药的重要评价手段[2]。黄芪葛根汤方源自古籍,益气健脾,滋阴清热,生津止渴,前期通过链脲佐菌素 (STZ)糖尿病和氢化可的松胰岛素抵抗小鼠实验证实其具有改善胰岛素抵抗、降血糖作用;在病理观察中发现,糖尿病大鼠病程持续一段时间后心肌线粒体增多异常明显,线粒体肿胀变性,嵴断裂、溶解,形成空泡区,黄芪葛根汤能明显改善心肌超微结构。因此,为进一步探讨该方对糖尿病心肌病的保护作用及机制,本研究通过建立2型糖尿病心肌病大鼠模型,观察黄芪葛根汤对心肌氧化应激和NF-κB表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠,体质量180~220 g,由广东省医学实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(粤)2003—0002,粤监证字2008A020,饲养环境符合医学实验动物环境设施要求。

1.1.2 药物与试剂 黄芪葛根汤由黄芪、葛根等组成,其浸膏每1 g相当于生药1.71 g,相对密度1.22(50℃),临用时用蒸馏水稀释至所需浓度;盐酸罗格列酮,贵州圣济堂制药有限公司生产,批号:20070502;STZ,美国Sigma公司产品;血糖试剂盒,上海科华生物工程股份有限公司;血脂检测试剂盒:甘油三脂 (TG),胆固醇 (TC),高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),北京中生北控生物科技股份有限公司;SOD,MDA,GSH-Px和组织蛋白测定试剂盒,南京建成生物工程公司,批号为20080912和20080829。总 RNA提取试剂 Trizol,Invitrogen公司,RT-PCR试剂盒,TIANGEN公司。

1.1.3 主要仪器 AV5421全自动生化分析仪(奥林巴斯公司产品);UV-1800型紫外可见光光度计 (北京瑞利分析仪器公司);AB2700 PCR扩增仪 (美国AB公司);PAC 300电泳仪 (美国BIO-RAD公司);Gel 100凝胶成像系统 (美国BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分组与给药 大鼠先用高脂高热量饲料喂养4周 (由基础鼠料加酪蛋白、蔗糖、猪油等按比例组成,其中基础鼠料52%,酪蛋白12%,蔗糖10%,猪油24%,磷酸氢钙2%,复合多维0.1%,矿物质0.4%,盐0.2%),再以小剂量STZ 30 mg/kg腹腔注射 (正常对照组同时采用柠檬酸缓冲液腹腔注射),1周后取血测空腹血糖 (FBG)和糖耐量。选择糖耐量异常 (2 hBG≥7.8 mmol/L)的60只成模大鼠纳入实验。成模大鼠随机分成五组 (模型组,罗格列酮组,黄芪葛根汤高、中、低剂量组),继续以高脂饲料喂养8周。正常组10只大鼠一直采用基础饲料喂养。每周称体质量1次,记录体质量、进食量、饮水量。采用代谢笼收集大鼠24 h尿液。各组分别按体质量灌胃给药,每天1次,正常组和模型组则予以等体积的蒸馏水,8周后处死动物取材。

1.2.2 标本采集与指标检测 末次给药后禁食12 h,大鼠经腹主动脉取血,3 500 r/min,4℃,离心10 min取上清,采用全自动生化分析仪检测空腹血糖 (FBG)和血脂。参考文献采用大鼠不禁食状态下下午所测得的随机血糖视为餐后血糖(PBG)。取血后处死大鼠,迅速取出心脏,剪除包膜、血管,取约100 mg左心室肌组织装入冻存管保存备用,择日在1~4℃条件下制成100 g/L心肌组织生理盐水匀浆液,按试剂盒方法测定SOD,MDA,GSH-Px。

1.2.3 RT-PCR检测心肌组织NF-κB mRNA表达按Trizol试剂说明提取心肌组织总RNA,取2 μg总RNA进行RT反应,然后取RT产物进行NF-κB和内参β-actin的PCR反应。其中β-actin的上游引物5'-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3',下游引物5'-GCAGTAATCTCCTTCTGCATCC-3', 扩 增 产 物600 bp。NF-κB 上游 引物 5'-GGGACTATGACTTGAATGCG-3',下 游 引 物 5'-CAGGCTAGGGTCAGCGTAT-3',扩增产物300 bp。NF-κB反应体系为:RT反应产物1 μL,β-Actin上、下游引物 (5 μmol/L)各 0.5 μL,NF-κB 上、下游引物 (10 μmol/L)各 1 μL ,2 ×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,总体积25 μL。NF-κB 反应步骤为:94℃ 5 min 1循环,94℃ 30、56℃ 30、72℃ 1 min共30循环,72℃7 min 1循环。PCR反应结束后,取10 μL产物于1.5%琼脂糖胶上电泳,用凝胶成像分析系统进行照相,测定各产物电泳条带光密度值,计算目的基因光密度和内参光密度比值作为NF-κB mRNA的表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般体征 (体质量、进食量、饮水量、尿量)观察 正常对照组大鼠毛色光亮、洁白,体态活泼,无多饮、多尿现象,体质量逐渐增加。造模大鼠在前4周高脂饲料喂养期体质量增加明显,其它外观体征与正常组无明显区别,但在注射STZ 1周后,体质量有所下降,随着时间的推移体质量增加明显,尤其是模型组大鼠,并出现明显的多饮、多食、多尿。经过各组药物干预治疗后,大鼠体质量、进食量和饮水量有不同程度改善。采用代谢笼收集24 h尿量,糖尿病模型组大鼠与正常对照组比较,尿量显著升高 (P<0.01);黄芪葛根汤高、中剂量组、罗格列酮组与模型组相比,尿量显著降低 (P<0.05或P<0.01),说明黄芪葛根汤、罗格列酮能明显改善糖尿病多尿症状(结果见表1)。

2.2 黄芪葛根汤对大鼠血糖的影响 由表1可见,与正常组相比,模型组空腹血糖和餐后血糖都显著升高 (P<0.01),说明2型糖尿病模型造模成功。与模型组比较,黄芪葛根汤高、中剂量组,罗格列酮组的空腹血糖明显降低;黄芪葛根汤中剂量组、罗格列酮组的餐后血糖也明显降低。

表1 黄芪葛根汤对糖尿病心肌病大鼠血糖和尿量的影响Tab.1 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood glucose and urinary volume in diabetic cardiomyopathy rats(±s,n=8)

表1 黄芪葛根汤对糖尿病心肌病大鼠血糖和尿量的影响Tab.1 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood glucose and urinary volume in diabetic cardiomyopathy rats(±s,n=8)

与正常组比较,▲▲ P<0.01;与模型组比较**P <0.01,*P <0.05。

组 别 剂量/(g·kg-1) FBG/(mmol·L-1) PBG/(mmol·L-1) 24 h尿量 (mL·g-1·100-1)正常组-5.55±0.58 7.09±1.56 4.82±1.35模型组 - 15.77±4.28▲▲ 17.14±4.75▲▲ 9.22±4.80▲▲黄芪葛根汤高剂量组 8 11.38±4.28* 12.34±5.27 4.39±1.49*黄芪葛根汤中剂量组 4 11.52±1.39* 11.24±5.11* 4.51±1.60*黄芪葛根汤低剂量组 2 14.36±2.33 14.07±5.65 6.14±3.94罗格列酮组 0.001 8.84±0.65** 9.74±3.76** 3.09±1.04**

2.3 黄芪葛根汤对大鼠血脂的影响 表2结果显示,与模型组比较,黄芪葛根汤各剂量均可显著降低模型大鼠的血清TC和LDL-C(P<0.05~P<0.01),黄芪葛根汤高、中剂量还可显著降低大鼠的TG水平 (P<0.05),中剂量明显升高大鼠的HDL-C水平 (P<0.05)。说明黄芪葛根汤具有良好的调血脂作用,有利于治疗糖尿病的脂代谢紊乱。

表2 黄芪葛根汤对糖尿病心肌病大鼠血脂的影响Tab.2 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood lipid in diabetic cardiomyopathy rats(±s,n=8)

表2 黄芪葛根汤对糖尿病心肌病大鼠血脂的影响Tab.2 Effects of Huangqi Gegen Decoction on blood lipid in diabetic cardiomyopathy rats(±s,n=8)

与正常组比较,▲▲ P <0.01;与模型组比较,**P <0.01,*P <0.05。

组 别 剂量 /(g·kg-1) TC/(mmol·L-1) TG/(mmol·L-1) HDL-C/(mmol·L-1) LDL-C/(mmol·L-1)正常组 —1.05±0.17 0.65±0.11 0.58±0.03 0.20±0.04模型组 — 1.50±0.10▲▲ 1.50±0.37▲▲ 0.50±0.07▲▲ 0.27±0.04▲▲黄芪葛根汤高剂量组 8 1.24±0.22** 1.16±0.22* 0.53±0.16 0.19±0.05**黄芪葛根汤中剂量组 4 1.13±0.16** 1.19±0.31* 0.59±0.13* 0.18±0.02**黄芪葛根汤低剂量组 2 1.38±0.09* 1.22±0.31 0.51±0.13 0.17±0.03**罗格列酮组 0.001 1.37±0.12** 0.91±0.16** 0.57±0.03* 0.22±0.05*

2.4 黄芪葛根汤对大鼠心肌SOD、MDA、GSH-Px的影响 表3结果表明,糖尿病心肌病模型组大鼠心肌SOD和GSH-Px活性显著低于正常组,MDA显著高于正常组 (P<0.01),提示大鼠心肌存在着过度的氧化应激反应。而黄芪葛根汤高、中、低剂量组心肌SOD活性都明显高于模型组,高、中剂量组心肌GSH-Px活性显著高于模型组,MDA水平明显低于模型组,提示黄芪葛根汤能明显提高心肌的抗氧化能力。

表3 黄芪葛根汤对糖尿病心肌病大鼠SOD、MDA、GSH-Px的影响Tab.3 Effects of Huangqi Gegen Decoction on SOD,MDA and GSH-Px in diabetic cardiomyopathy rats(±s,n=9)

表3 黄芪葛根汤对糖尿病心肌病大鼠SOD、MDA、GSH-Px的影响Tab.3 Effects of Huangqi Gegen Decoction on SOD,MDA and GSH-Px in diabetic cardiomyopathy rats(±s,n=9)

与正常组比较,▲▲ P <0.01;与模型组比较,**P <0.01,*P <0.05。

组 别 剂量/(g·kg-1) SOD/(U·mgprot-1) MDA/(nmol·mgprot-1) GSH-Px/(活力单位)正常组-80.85±19.63 3.09±0.46 56.65±9.72模型组 - 55.10±11.25▲▲ 3.77±0.36▲▲ 43.90±10.24▲▲黄芪葛根汤高剂量组 8 77.02±15.64** 3.23±0.55* 58.37±16.11*黄芪葛根汤中剂量组 4 76.88±9.52** 3.30±0.59* 57.92±6.94**黄芪葛根汤低剂量组 2 69.90±12.37* 3.53±0.80 52.69±11.89罗格列酮组 0.001 71.58±17.37* 3.27±0.60* 58.47±10.01**

2.5 黄芪葛根汤对大鼠心肌NF-κB mRNA表达的影响 RT-PCR结果表明,糖尿病心肌病模型组大鼠的心肌NF-κB mRNA表达明显高于正常组(P<0.05),而黄芪葛根汤高、中剂量组都能明显抑制NF-κB mRNA的表达 (P<0.05)。(见图1和图2)

图1 心肌NF-κB RT-PCR电泳图Fig.1 Electrophoresis picture of NF-kappa B in myocardium detected by RT-PCR

图2 心肌NF-κB mRNA表达比较Fig.2 Expression level of NF-kappa B in myocardium(±s,n=6)

3 讨论

糖尿病是一种由多种原因引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱综合征,这种代谢的紊乱可引起心肌细胞的能量代谢障碍,最终导致心脏功能和结构的异常。目前糖尿病心肌病作为糖尿病的一种独特的并发症已经得到国内外学者的公认[3-7],但由于本病隐匿性较强,容易被漏诊或误诊,因此一旦发现,病情严重复杂,治疗矛盾多,预后较差,如果能在疾病的早期采取干预措施将对本病产生积极的影响。中药黄芪、葛根对糖尿病、心血管疾病均有较好的治疗效果,且二者作为药对配伍应用于糖尿病及并发症的治疗历史悠久。为探讨黄芪葛根汤对糖尿病心肌的保护作用,通过复合因素建立和临床特征相似的2型糖尿病心肌病大鼠模型,已证实该模型具有明显的多饮、多食、多尿、糖脂代谢紊乱以及糖尿病心肌病的典型病理特征为心肌细胞肥大、凋亡、灶性坏死,心肌间质纤维化。本研究主要探讨该方对糖尿病大鼠血糖、血脂、心肌氧化应激和NF-κB表达的影响。

高血糖是糖尿病最基本的病理特征,也是引起糖尿病一些慢性并发症的重要原因。脂质代谢紊乱既可加重糖代谢紊乱,又可使糖尿病血管并发症发生率及病死率明显增高。因此,积极采取降糖降脂措施有利于2型糖尿病及其并发症的治疗。本研究证实,黄芪葛根汤能明显降低大鼠空腹血糖和餐后血糖,而且具有良好的调节血脂作用,说明该方的长期应用将有利于代谢综合征的防治。

2型糖尿病病人存在氧化应激的增强已被国内外许多研究证实,在持续高糖状态下,ROS生成增加可能是糖尿病各种并发症发生的中心环节。同时,异常的脂质代谢所产生的具有毒性的氧化型LDL在体内的大量蓄积,使细胞引起TNF-α和IL-6等增加,氧化应激反应增强,加重了心肌细胞和微血管内皮细胞损伤,最终导致糖基化终末产物(AGES)在微血管内膜、周膜以及心肌间质沉积并与胶原蛋白交联导致纤维化。近年的研究表明,氧化应激还与心肌细胞凋亡有着极其密切的关系。由此可知氧化应激在糖尿病心肌病变过程中扮演着非常重要的角色。

在缺乏抗氧化物的有效补充的情况下,氧化应激逐渐加重,进一步导致各种相关细胞内信号转导系统的激活,包括NF-κB。NF-κB是一种广泛存在于体内多种细胞的核转录因子,被称为炎症反应链的“基因开关”,参与许多细胞因子的表达调控,在机体的炎症反应、凋亡调控、免疫等方面发挥重要作用。糖尿病时蛋白质的非酶糖化、AGES和其特异受体结合、氧化应激产生的ROS等均可激活NF-κB[8],激活的 NF-κB 可启动下游基因的转录(TNF-α、TGF-β1 等)[9]。

本研究结果显示,糖尿病心肌病模型大鼠心肌MDA显著增高,SOD、GSH-Px活性显著降低,证实了氧化应激性损伤与糖尿病心肌病的发病关系密切,而且心肌组织NF-κB表达明显增强。黄芪葛根汤能明显增强心肌内抗氧化酶活性及减少脂质过氧化,抑制糖尿病心肌NF-κB表达,从而预防或延缓心肌病变的发生,对糖尿病心肌发挥保护作用。

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