柚皮素大鼠在体肠吸收动力学的研究

马 燕， 林宝琴， 李卫中， 胡晓峰

(1.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006;2.慧谷医药有限公司，广东广州 510610)

柚皮素是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物。国内关于柚皮素的研究主要包括:中药材和中成药中柚皮素的定量测定［1-2］、化学成分的分离鉴别和提取工艺的研究等［3-4］。国外关于柚皮素的研究主要包括药理作用和药物动力学两个方面［5］。文献报道柚皮素具有抑制CYP3A4活性［6-7］，抑制人细胞色素酶 P450 活性［8］、抗氧化［9］、抗 溃疡［10］、抑制乳腺癌增殖［11］、抗炎［12］等生理活性。柚皮素还具有很好的镇咳、化痰、平喘等药理活性［13］。

虽然柚皮素具有广泛的药理活性，但由于其水溶性和脂溶性均不好，口服生物利用度低，尚未应用于临床。据文献报道柚皮素在兔体内的生物利用度以游离柚皮素计仅为4%，以酶解后柚皮素总质量分数计为8%［14］。因此需要深入研究柚皮素的口服吸收机制和体内过程，尤其在新药和药物制剂的处方前研究中，有必要对药物进入体内的吸收情况进行预测。小肠是药物吸收的主要部位，大鼠在体肠灌流法能很好的模拟人体的体内环境，且结果与人体实验的结果相关性良好，因此可以减少剂型设计的盲目性，为剂型开发研究提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BT100—2J恒流泵 (保定兰格);UV—2100紫外分光光度计 (UNIC上海有限公司);HN—S21CR4恒温水浴箱 (上海锦屏仪器仪表有限公司)。

1.2 试剂及药品 柚皮素 (HPLC检测纯度≥98%，西安慧科植物开发有限公司，批号:NA20100710);酚红 (天津市福晨化学试剂厂，批号:20100610);Krebs-Ringer缓冲液 (每1 L内含NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl20.37 g，MgCl20.22 g，NaH2PO40.22 g，葡萄糖1.4 g和NaHCO31.37 g)自制;其他试剂均为分析纯。

1.3 动物 健康雄性SD大鼠，体质量 (250±50)g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(粤)2008—0020。

2 方法与结果

2.1 灌流液中柚皮素的含有量测定方法

2.1.1 柚皮素最大吸收波长的确定 精密量取1 mg/mL柚皮素贮备液0.2 mL(称取柚皮素适量，以无水乙醇溶解并定容，制得质量浓度为1 mg/mL柚皮素贮备液)，置于10 mL量瓶中，用 Krebs-Ringer缓冲液定容，得到20.0 μg/mL的柚皮素对照溶液;量取上述柚皮素对照溶液2 mL，加入10%氢氧化钠溶液2 mL，显色40 min，以Krebs-Ringer液为空白，按分光光度法在200～600 nm波长范围内进行扫描，由图1可知柚皮素在425 nm有较大吸收，且此波长下酚红溶液无干扰，因此选择425 nm作为柚皮素的测定波长。

图1 柚皮素 (A)和酚红 (B)的紫外扫描图谱Fig.1 UV spectrums of naringenin(A)and phenol red(B)

2.1.2 标准曲线的绘制 分别精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的柚皮素贮备液 (1 mg/mL)，置于10 mL量瓶中，用Krebs-Ringer缓冲液定容，得到10、20、30、40、50、60 μg/mL的标准溶液;分别量取上述标准溶液2 mL，加入10%NaOH 2 mL，显色40 min后，以Krebs-Ringer缓冲液为空白，于425 nm处测定吸光度A值。以质量浓度对吸收度进行线性回归，得标准曲线方程y=0.014 6x+0.038(r=0.999 8，n=3)，在10～60 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

2.1.3 柚皮素在肠灌流液中稳定性的考察 将大鼠全肠段置于循环系统中，将Krebs-Ringer缓冲液100 mL灌注于恒流泵中，以2.5 mL/min速率循环4 h。用循环后的肠液配制40.0 μg/mL的柚皮素肠灌流液，于37℃水浴放置4 h，在预定时间取样，测定吸光度值，计算RSD值为0.75%。结果显示柚皮素在肠灌流液中4 h内稳定。

2.1.4 重复性考察 分别精密量取10、25、40 μg/mL的柚皮素标准溶液2 mL，按2.1.2项下操作，测定吸光度A值。代入标准曲线方程计算柚皮素质量浓度及相对标准偏差。结果显示RSD值小于1.97%，重复性符合方法学要求。

2.1.5 精密度考察 分别精密量取10、25、40 μg/mL的柚皮素标准溶液2 mL，按2.1.2项下操作，测定吸光度A值。日内测定3次，连续测定3 d，根据标准曲线计算rfjg浓度及相对标准偏差。结果表明日内和日间RSD值分别为1.15%和1.28%。

2.1.6 回收率考察 精密量取柚皮素对照品贮备液 (1 mg/mL)0.1、0.2、0.4 mL置于10 mL量瓶中，用 Krebs-Ringer缓冲液稀释，定容至10，20，40 μg/mL的柚皮素溶液，按2.1.2项下操作，测定吸光度A值，根据标准曲线计算质量浓度，求得平均回收率为99.68%，相对标准偏差为1.21%。见表1。

表1 柚皮素回收率结果Tab.1 Analytical recovery for determination of naringenin by UV(n=5)

2.2 酚红标准曲线的绘制 用Krebs-Ringer液配制质量浓度为10、15、20、25、30、40 μg/mL的系列浓度酚红溶液，分别精密吸取1 mL，加入1 mol/mL NaOH溶液10 mL，显色5 min。以Krebs-Ringer液为空白，在560 nm测定吸收度，以吸光度对酚红质量浓度进行线性回归，得标准曲线方程为y=0.017 7x-0.009 4(r=0.999 3，n=3)，酚红在10～40 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

2.3 大鼠在体肠灌流实验

2.3.1 实验操作［15］手术前大鼠禁食18 h，自由饮水，称定质量，以3%戊巴比妥钠溶液0.15 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后将大鼠背位固定于手术台板上，沿腹部正中线切开腹部 (约3 cm)。对需要观察的部分，在两端剪切后插管，结扎，装好恒流泵循环装置。先用少量37℃的生理盐水冲洗肠段，再用空气将溶液排净。接着以10 mL空白灌流液灌注肠道，之后将含有药物和酚红 (20.0 μg/mL)的100 mL灌流溶液注于恒流泵中，开始以5.0 mL/min体积流量平衡2 min，然后以2.5 mL/min速率灌流。分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h取样3 mL，同时补加相同体积的Krebs-Ringer液配制的酚红溶液(20.0 μg/mL)。

将不同时间点的样品经0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，精密吸取续滤液2 mL，加入10%NaOH，以Krebs-Ringer液为空白，显色后于最大吸收波长处测定吸光度值，代入标准曲线计算浓度。根据酚红的浓度变化校正供试液的体积，准确计算肠循环液中的剩余药量，以剩余药量的对数值与取样时间作图得一直线，根据直线斜率求出吸收速率常数Ka，由4 h剩余药量的变化值对零时刻剩余药量的比值求出药物吸收率［16，17］。

2.3.2 浓度对药物吸收的影响 用Krebs-Ringer缓冲液配制30.0，40.0，50.0 μg/mL柚皮素溶液(酚红质量浓度为20.0 μg/mL)，将不同质量浓度的供试液经大鼠在体整肠段回流4 h后，考察药物浓度对吸收的影响，整肠段自十二指肠上端起到回肠下端止。见表2。

表2 不同质量浓度柚皮素的吸收率和吸收速率常数(±s，n=3)Tab.2 Absorption percentage and absorption rate constant of naringenin at different concentration(±s，n=3)

表2 不同质量浓度柚皮素的吸收率和吸收速率常数(±s，n=3)Tab.2 Absorption percentage and absorption rate constant of naringenin at different concentration(±s，n=3)

质量浓度/(μg·mL-1)吸收率/%吸收速率常数Ka/h-1 30.0 34.24±2.31 0.195±0.002 40.0 38.35±2.20 0.203±0.006 50.0 43.61±0.16 0.211±0.009

表2结果表明，柚皮素供试液在大鼠小肠回流4 h后，吸收率和吸收速率常数随质量浓度的增加而依次递增。将吸收量对质量浓度进行线性回归得方程Q=0.47C+19.9(r=0.997 3)，柚皮素的吸收量与质量浓度呈线性关系。对吸收率和吸收速率常数进行方差分析，比较不同药物质量浓度对药物吸收的影响。结果显示不同质量浓度下柚皮素的吸收率有显著性差异 (P＜0.05)，而吸收速率常数无显著性差异，提示药物的吸收以被动扩散为主。

2.3.3 不同肠段对药物吸收的影响 采用40.0 μg/mL柚皮素供试液分别在十二指肠、空肠、回肠和结肠4个肠段回流，考察大鼠各肠段的吸收情况。分段考察的各肠段区间如下:十二指肠段自幽门1 cm处开始往下10 cm止;空肠段自幽门15 cm起往下10 cm止;回肠段自盲肠上行20 cm开始往下10 cm止;结肠段从盲肠后端开始往下10 cm止。供试液经不同肠段循环回流4 h后，小肠对药物的吸收率和吸收速率常数Ka见表3。

表3 不同肠段柚皮素的吸收率和吸收速率常数(±s，n=3)Tab.3 Absorption percentage and absorption rate constant of naringenin at different intestines segments(±s，n=3)

表3 不同肠段柚皮素的吸收率和吸收速率常数(±s，n=3)Tab.3 Absorption percentage and absorption rate constant of naringenin at different intestines segments(±s，n=3)

大鼠肠段 吸收率/% 吸收速率常数Ka/h -1十二指肠15.96±0.25 0.101±0.008空肠 12.67±0.78 0.085±0.011回肠 7.42±1.43 0.063±0.009结肠5.46±0.51 0.035±0.013

结果表明，柚皮素供试液在十二指肠、空肠、回肠、结肠的吸收率和吸收速率常数依次递减，即十二指肠＞空肠＞回肠＞结肠，且有显著性差异(P＜0.05)。以剩余药量的对数值对时间t进行线性回归，相关系数r均大于0.950 0，表明在各肠道药物的吸收符合一级动力学过程。

2.3.4 胆汁分泌对药物吸收的影响 将大鼠分为结扎胆管和不结扎胆管的两组，分别进行整肠段回流实验，考察胆管排泄对40.0 μg/mL柚皮素吸收的影响。供试液经大鼠在体肠循环回流吸收试验4 h后，结扎和未结扎胆管的小肠对药物的吸收率和吸收速率常数Ka见表4。结果表明，未结扎胆管大鼠的吸收率和吸收速率常数均高于结扎组，且有显著性差异 (P＜0.05)。

表4 胆汁分泌对柚皮素吸收率和吸收速率常数的影响 (±s，n=3)Tab.4 Effects of bile secretion on the absorption percentage and absorption rate constant of naringenin(±s，n=3)

表4 胆汁分泌对柚皮素吸收率和吸收速率常数的影响 (±s，n=3)Tab.4 Effects of bile secretion on the absorption percentage and absorption rate constant of naringenin(±s，n=3)

胆管结扎情况 吸收率/% 吸收速率常数Ka/h-1未结扎 38.35±2.20 0.203±0.005结扎30.77±4.80 0.164±0.004

3 讨论

3.1 水的吸收与转运，小肠在吸收的过程中，不仅吸收药物也吸收水分，使供试液体积减少，故不能用直接测定药物浓度的方法计算剩余的药量。本实验采用在肠道pH值条件下不被吸收的弱酸性药物酚红标示回流液体积的变化，从而可较准确的求算药物的吸收量［18］。

3.2 由于大鼠的生理结构中没有胆囊，输胆管开口于十二指肠的上端，分泌的胆汁直接进入十二指肠。胆汁中的主要成分胆汁酸具有良好的表面活性作用，能够改善药物的溶解性能，并通过增加生物膜的通透性促进具有特殊吸收机制的药物吸收。

3.3 柚皮素为二氢黄酮类化合物，定量测定时通过加入显色剂10%NaOH显色后，再采用紫外分光光度计检测，可以很好的避免肠液的干扰性，而且此法准确、简便、易行。

3.4 本实验从药物吸收动力学，药物质量浓度，不同肠段及胆汁分泌等方面探讨了柚皮素的吸收机理:①在30～50 μg/mL质量浓度范围内，柚皮素的吸收量与质量浓度呈线性关系 (r=0.997 3)，吸收量随药物质量浓度的增加而增加，无高浓度饱和现象，吸收速率常数Ka基本不变;②在对药物于不同肠段吸收情况的考察中，以剩余药量的对数值对时间t进行线性回归，各回归直线均有r＞0.950 0，表明在肠道各部位药物的下降与循环时间呈线性关系，故为一级吸收动力学;③由胆汁分泌对吸收的影响试验结果可知，在结扎胆管的大鼠和未结扎胆管的大鼠小肠对柚皮素的吸收存在显著性差异，说明胆汁的分泌影响药物的吸收，也有可能与柚皮素的肝肠循环有关［19］。综上所述，初步推测柚皮素在肠内的吸收主要为被动转运方式。

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