酶电极法测定鸡精中谷氨酸钠含量

冯东，王丙莲，*，李雪梅，李大海，刘仲惠

（1.山东省科学院生物研究所，山东济南 250014；2.山东省生物传感器重点实验室，山东济南 250014）

鸡精，是以鸡肉粉、鲜味剂、淀粉、蔗糖、食盐等为原料，经过配制、混合、造粒、干燥等过程加工而成的一种具有鸡肉鲜香风味的调味品，因其特有的风味而越来越受到广大消费者的喜爱。目前人们多用鸡精做汤料的增味剂，谷氨酸钠（麸氨酸钠）是味精的主要成分，也是鸡精产品中的主要鲜味物质，作为鸡精产品的主要原料，其含量一般标示量为35%左右[1]。由于鸡精类产品中谷氨酸钠检测目前尚无国家标准或行业标准，而某些企业标准中也未制定谷氨酸钠的标准测定方法，虽然相关标准中谷氨酸钠主要测定方法有3种—高氯酸滴定法、旋光法和酸度计法[2－5]，但由于鸡精成分比味精复杂得多，其中旋光性和水不溶性物质的存在，导致上述方法不适用。而高效液相色谱分析费用昂贵且操作复杂，因此建立一种切实可行的、适合于鸡精中谷氨酸钠含量的测定方法成为必要。

酶电极分析法是将酶蛋白分子采用交联作用固定化制成固定化酶膜，再与电化学基础电极相结合，构成酶电极生物传感器用于特异性底物分析的一项生物技术。该方法具有专一性高、稳定性好、检测快速而灵敏等特点[6]。酶电极研究起步于20世纪60年代，自2000年以来，生物传感器技术在环境监测[7]、食品安全[8]、军事[9]和医学[10－11]等方面的应用日益广泛，其用于食品谷氨酸、谷氨酸钠的检测研究较少[12]。本研究中，我们采用谷氨酸酶电极分析仪测定鸡精中谷氨酸钠的含量，并对其准确性和稳定性进行了评估，通过重现性和回收率等试验，证明该方法测定结果准确、高效，具有实际使用意义。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

谷氨酸氧化酶膜：谷氨酸氧化酶SIGMA公司生产，利用戊二醛交联法制成固定化酶膜圈，置于冰箱待用；缓冲溶液为0.1 mmol/L，pH=7.2的磷酸缓冲液；采用市售鸡精；谷氨酸对照品；其它试剂均为分析纯。

SBA－40E生物传感分析仪由山东省科学院生物研究所自制。

1.2 测定原理

生物传感分析仪SBA－40E利用酶促反应来定量，其样品分析原理如下：

SBA－40E生物传感分析仪结构示意图如图1所示。

样品室侧面装有过氧化氢电极，电极表面覆盖固定化的谷氨酸氧化酶酶膜。含有谷氨酸钠的底物在样品室内与固定化谷氨酸氧化酶层接触并反应，产生的H2O2由过氧化氢电极检测并转变为电信号，该电流信号经放大处理显示测定结果，并自动记录和打印。因为产生的H2O2的量与谷氨酸质量浓度成线性比例关系，故可测定样品中谷氨酸含量，进而换算得谷氨酸钠含量。

酶电极及固定化酶膜结构如图2所示。

电极系统包括两个酶电极及其插头，固定化谷氨酸氧化酶酶层通过酶膜片及O型密封圈固定于酶电极顶端。系统通过固定化酶层实现对谷氨酸、谷氨酸钠的催化反应，生成的H2O2由过氧化氢电极检测并显示，从而实现对谷氨酸、谷氨酸钠的测定。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酸标准溶液

准确称量谷氨酸，蒸馏水稀释成质量浓度依次为0.5、1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL 的谷氨酸标准溶液，密封放置，用于检验生物传感分析仪的线性范围和检测灵敏度。

1.3.2 SBA－40E生物传感分析仪环境要求

该分析仪需要0.5平方米的工作台，工作台平整洁净，避免日晒。操作环境温度要求15℃～35℃，相对湿度低于90%。

1.3.3 测定步骤

1.3.3.1 SBA－40E生物传感分析仪定标

为保持谷氨酸酶膜活性，系统缓冲剂采用0.1 mmol/L，pH=7.2的磷酸盐缓冲液。采用100 mg/100 mL谷氨酸溶液作为分析仪定标液。SBA－40E生物分析仪开机后，系统进行自检，后指示灯提示进样。用微量进样器准确吸取25 μL定标液快速注入反应室，仪器自行运转，并显示测定结果。根据仪器提示用谷氨酸标准液重复定标几次，最终SBA－40E自动定标为100，然后可进行样品测定。

1.3.3.2 鸡精样品测定

精确称取适量鸡精样品，蒸馏水使其充分溶解，并按一定比例稀释，调整pH为6～8。根据分析仪“进样”指示，准确吸取25 μL稀释的鸡精样品，并注入反应池。反应20 s后分析仪自行显示并打印测定结果，根据分析仪测定数值，结合鸡精稀释倍数和谷氨酸、谷氨酸钠换算系数，即可计算鸡精中谷氨酸钠含量。

1.4 数据处理方法

采用t检验分析，比较液相色谱仪法与SBA－40E生物传感分析仪测定结果之间的显著性差异，判断SBA－40E生物传感分析仪能否达到液相色谱仪对谷氨酸钠检测的准确度。

2 结果与分析

2.1 测定的最适pH

谷氨酸氧化酶作为一种蛋白质，过酸或过碱环境均导致其活性下降，以致失活，从而严重影响SBA－40E分析仪测定的准确度。本试验采用磷酸盐缓冲体系，配制pH 1～10的缓冲液，结果表明，pH7.0左右时谷氨酸氧化酶酶活性最高。鉴于此，SBA－40E生物传感分析仪系统选用pH7.2的磷酸缓冲液。待测鸡精样品溶液需调整pH到6～8，强酸或强碱样品液均将导致谷氨酸氧化酶酶膜失活。

2.2 线性范围确定

上述试验条件下，分别测定谷氨酸系列标准溶液（0.5、1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL），进样体积25 μL。依据SBA－40E生物传感分析仪显示结果绘制标准曲线，如图3。

图3结果表明，在1 mg/100 mL～100 mg/100 mL范围内，SBA－40E生物传感分析仪显示值与谷氨酸的质量浓度之间呈良好的线性关系。谷氨酸质量浓度为X，显示值为Y，线性回归方程为：y=0.999 19－0.033 2x，相关系数R为0.999 86。该质量浓度范围内的谷氨酸可由SBA－40E直接检测。超出该质量浓度范围时，SBA－40E显示值远远偏离回归曲线，由此可判断该方法对谷氨酸的检测下限与检测上限分别为1mg/100mL、100 mg/100 mL，相应的谷氨酸钠的检测下限、检测上限分别为1.27 mg/100 mL、127 mg/100 mL。谷氨酸钠质量浓度高于其检测上限时需要稀释测定。

2.3 该方法的回收率检验

本研究利用回收试验进一步验证该方法的准确性。最佳试验条件下，取市售3种品牌鸡精样品，稀释后每个样品平均分成2份，其中一份加入等体积质量百分比浓度为30%的谷氨酸钠对照溶液做回收试验。按照“1.3.3”步骤测定各试样谷氨酸钠含量。由回收率计算公式：P=（加标试样测定值－试样测定值）/加标量×100%，结果见表1。

表1 加标回收率（n=5）Table 1 Recovery of standard addition（n=5）

由表1中的数据可知，用酶电极法测定鸡精样品回收率为99.3%～101.2%，处于98%～102%之间，表明该方法用于鸡精中谷氨酸钠含量的测定准确度较高。

2.4 酶电极法与高效液相色谱法测定鸡精谷氨酸钠含量的对比试验

取5种鸡精样品，按相应倍数稀释后，分别用酶电极法、高效液相色谱法（HPLC）、高氯酸滴定法进行谷氨酸钠含量测定。每个测试重复6次，试验结果如表2所示。

表2 鸡精谷氨酸钠含量对比测试结果（n=6）Table 2 Comparative test results for sodium glutamate in chicken essence between SBA-40E and HPLC，perchloric acid titration

表2数据显示，测定鸡精中谷氨酸钠含量，酶电极法与高效液相色谱法、高氯酸滴定法相比较无显著差异（P＞0.05）。综上表明，采用酶电极法检测鸡精中谷氨酸钠含量准确度高亦较高，而酶电极法较之液相色谱分析和高氯酸滴定具备操作简单、成本低廉的优势，故SBA－40E生物传感分析仪有望代替高效液相色谱、高氯酸滴定法等，成为测定鸡精中谷氨酸钠含量的新方法、新手段。

2.5 该方法的专一性验证

作为食品添加剂的5′鸟苷酸二钠、5′肌苷酸钠、维生素B2、白糊精等与谷氨酸钠共存于鸡精，本试验验证了酶电极法对谷氨酸钠的检测专一性及其抗干扰能力。配制5′鸟苷酸二钠、5′肌苷酸钠、维生素B2、白糊精等干扰物的质量浓度为50 mg/100mL的溶液，利用SBA－40E进行含量测定，并以50 mg/100mL的谷氨酸钠标准液作对比，结果见表3。

表3 SBA-40E生物传感器的专一性试验（n=6）Table 3 Specificity test of the biosensor SBA-40E for sodium glutamate mg/100 mL

由表3可以看出，SBA－40E能够准确测定溶液中谷氨酸钠含量，而对其它几种鸡精中的食品添加剂均无明显响应，说明该方法对鸡精谷氨酸钠的专一性较高，用于鸡精中谷氨酸钠含量测定时能有效排除其它常见杂质的干扰。

2.6 该方法的重现性

取某品牌鸡精样品分为6份，采用酶电极法对稀释为100 mg/100 mL的鸡精样品谷氨酸钠进行测定，观察SBA－40E的重现性，结果如表4。

表4 SBA-40E的重现性试验Table 4 Reproduicibility test of the biosensor SBA-40E %

相对标准偏差（RSD）为0.74%。该试验结果证实该方法用于鸡精谷氨酸钠检测具有较好的重现性。

2.7 该方法的稳定性

运用SBA－40E生物传感分析仪对已知浓度的谷氨酸钠溶液进行测试，每5天测定1次，每次6个平行，连续测定3个月，考察分析仪的稳定性。数据显示，分析仪测试结果没有明显变化，酶膜活性稳定，这说明谷氨酸氧化酶酶膜3个月内能保持较高活性，SBA－40E生物传感器在此期间亦具有良好的稳定性。3个月后可通过更换谷氨酸氧化酶酶膜实现酶电极分析仪的继续使用。

3 结论

本研究利用生物传感技术建立了SBA－40E型传感分析仪，创建了简洁、快速检测鸡精谷氨酸钠含量的新方法。该方法直接测定鸡精中的谷氨酸钠，无需进行样品前处理；检测灵敏度高，检出下限为1.27 mg/100 mL；加标回收率高，为99.3%～101.2%；检测速度快，每个样品测试仅需20 s；检测专一性强，不受鸡精中其他添加剂，5′鸟苷酸二钠、5′肌苷酸钠、维生素B2和白糊精等的干扰；重现性及稳定性好；结果准确可靠，相对标准偏差为0.74%；与高效液相色谱仪等相比较，其测定结果无显著差异（P＞0.05）；线性范围宽，适用于目前绝大部分鸡精样品中的谷氨酸钠含量测定；且该方法操作简单，使用成本低，可使用分析纯试剂，更适于味精行业中谷氨酸钠含量的监控。因此，本方法有望代替高效液相色谱法和高氯酸滴定法，成为当前鸡精等调味料生产过程中谷氨酸、谷氨酸钠等监控的新方法。

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