碧螺春茶提取物抗氧化活性研究

王桃云，沈雪林，钱玮，顾华杰，胡翠英，朱安超

（1.苏州科技学院化学与生物工程学院，江苏苏州 215009；2.苏州市种子管理站，江苏苏州 215011）

抗氧化活性物质可抑制自由基反应，从而起到减少心血管疾病、减缓衰老和减少癌症发生率等生理作用[1]。所以从天然产物中寻找安全和有效的抗氧化剂成为研究的热点之一。

碧螺春茶叶原产于苏州市洞庭东、西山，其“碧螺春”之名来自康熙御赐。碧螺春形美、色艳、香浓、味醇的特点使其成为我国的十大名茶之一。碧螺春茶叶中富含以茶多酚为主的抗氧化活性物质，笔者通过研究在不同的抗氧化体系中碧螺春茶提取物的抗氧化特性，并与Vc和槲皮素的抗氧化性进行比较，以期为碧螺春茶资源的深度开发，合理利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

槲皮素、亚油酸：Sigma公司，色谱纯；抗坏血酸（VC）、二丁基羟基甲苯（BHT）、双氧水、硫酸铁、水杨酸、邻苯三酚、三氯乙酸、没食子酸、硫代巴比妥酸（TBA）、碘化钾等：均为分析纯。猪油：市售肥猪板油煎制；碧螺春茶叶：苏州市吴中区西山碧螺春茶厂。

UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津仪器有限公司；MDF-u4086S型超低温冰箱：日本三洋；N-1100S-WD型旋转蒸发仪：日本东京理化；LGJ-10型冷冻干燥机：北京四环科仪。

1.2 方法

1.2.1 碧螺春茶提取物制备

将碧螺春茶烘干，粉碎过100目筛，称取碧螺春干粉400 g，以1∶20料液比加入80%乙醇，60℃回流萃取两次，每次3 h，5 000 r/min离心20 min，合并提取液。将所得提取液与等体积石油醚在分液漏斗中混匀分层，弃上相，所得下相用旋转蒸发仪浓缩至20 mL。将浓缩液置于超低温冰箱中处理至完全冻结，然后用冷冻干燥机冷冻干燥24 h，将所得碧螺春茶提取物干粉用蒸馏水溶解，分别配成试验所需的不同浓度的溶液，备用。

1.2.2 EBT对羟基自由基（·OH）的清除作用[2-3]

利用H2O2对Fe2+混合产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510 nm下有最大吸收。各试管中分别加入不同浓度的EBT（或VC、槲皮素）溶液 2 mL，9 mmol/L的水杨酸-乙醇 2 mL，9 mmol/LFeSO42 mL，最后加入8.8 mmol/LH2O2启动反应，反应0.5 h，以蒸馏水为空白对照，在510 nm下测量各浓度的吸光度。以水杨酸-乙醇2 mL，9 mmol/L FeSO42 mL，不同浓度的EBT（或VC、槲皮素）溶液2 mL为本底吸收。

·OH清除率的计算公式为：

清除率/%=[A0－（Ax－ Axo）]/A0× 100

式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入提取物溶液后的吸光度；Axo为不加 H2O2、EBT（或 VC、槲皮素）溶液本底的吸光度。

1.2.3 EBT对超氧阴离子自由基的清除作用[4-5]

将 EBT（或 VC、槲皮素）分别配成浓度为 2.0、5.0、8.0、11.0、14.0 μg/mL 的溶液。按表 1加样于具塞比色皿中，迅速摇匀后每隔10 s用紫外-可见分光光度计在320 nm下测定相应吸光度值，至吸光度值稳定为止（10 mmol/L HCl溶液为参比）。清除率计算公式为：

清除率/%=（P0－ P）/P0× 100

式中：P0为邻苯三酚的自氧化法速率，P为加入EBT（或VC、槲皮素）溶液后邻苯三酚自氧化法速率，单位均为吸光度每分钟的增值。

表1 邻苯三酚试验加样表Table 1 The dosages of the pyrogallol method

1.2.4 EBT对烷基自由基清除率的测定[6]

取2.5 mL 95%乙醇、2.5 mL 0.1 mol/L pH8.0磷酸缓冲液、0.05 mL亚油酸和0.5 mL EBT（或VC、槲皮素）样品液，充分混合，用10 W紫外灯外光照射60 min，然后加入2 mL三氯乙酸（20%）和0.5 mL硫代巴比妥酸（3%），95℃水浴反应90 min，冰浴冷却，以5 000 r/min离心20 min，在532 nm波长下测定吸光度。空白组以等体积双脱氧水代替EBT（或VC、槲皮素）样品液。烷基自由基清除率的计算公式为：

清除率/%=（A0－Ai）/A0×100

式中：A0为空白的吸光度；Ai为加样品液的吸光度。

1.2.5 EBT抑制油脂氧化效果测定[7]

油脂暴露在空气中易氧化形成自由基，自由基与空气中的氧反应生成自由基和过氧化物，可以用油脂的POV值来评价其氧化程度，POV值越小，则油脂被氧化的程度越小。

称取已测定POV的猪油4份，每份40.0 g置于250 mL的锥形瓶中，第1份加入6 mL乙醇作为空白对照，第2份加入 6 mL、0.5 mg/mL VC，第3份加入6 mL、0.5 mg/mL EBT，充分振摇后，置65℃恒温干燥箱中，每隔24小时取2.0 g油样测定POV值。每次取样后充分振摇锥形瓶，以混入足够的空气。POV测定方法：按照动植物油脂过氧化值测定国家标准（GB/T5538-2005）的方法测定。

过氧化值计算公式：

式中：V1是用于测定的硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；V0是用于测定猪油的硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；C 是硫代硫酸钠标定浓度，（mol/L）；M 是试样的质量，g。

2结果与分析

2.1 EBT对羟基自由基（·OH）的清除作用

按1.2.2所述方法，得不同浓度下EBT、Vc和槲皮素对·OH的清除率，如图1所示。

由图1可知，随着EBT、槲皮素和Vc 3种物质在反应液中浓度的增加，对羟基自由基的清除率均呈上升趋势。EBT对Fenton体系产生的羟基自由基的清除作用明显高于槲皮素和Vc，在试验范围内其添加量与羟基自由基清除率呈正相关。EBT对羟基自由基的清除作用明显优于Vc和槲皮素。

2.2 EBT对超氧阴离子自由基（O2-·）清除作用

按1.2.3所述方法，得不同浓度下EBT、Vc和槲皮素对O2-·的清除率，如图2所示。

由图2可知，EBT、Vc和槲皮素对超氧阴离子自由基均有不同程度的清除作用，而且这3种抗氧化剂对超氧阴离子的清除作用随其浓度的增加而增大。相同浓度下，Vc对O2－·清除效果最好，而EBT与槲皮素对超氧阴离子的清除作用基本相当。

2.3 EBT对烷基自由基（R·）的清除作用

按1.2.4所述方法，得不同浓度下EBT、VC和槲皮素对烷基自由基的清除率，如图3所示。

由图3可知，EBT、槲皮素和Vc对烷基自由基有清除作用，且清除效果与添加的剂量正相关。EBT对烷基自由基的清除能力比槲皮素和Vc都强，槲皮素和Vc对烷基自由基的清除作用基本相当。

2.4 EBT对油脂氧化的抑制作用

按1.2.5所述方法，得不同浓度下EBT和VC对油脂过氧化抑制作用效果，结果如图4所示。

由图4可知，在前5天内，油脂氧化作用很弱，EBT和Vc对油脂过氧化也没有明显的抑制作用。从第6天开始，EBT和Vc显示出明显的油脂氧化抑制作用，在开始时，EBT和Vc对油脂氧化抑制作用相当，但随着处理时间加长，EBT的油脂氧化抑制作用要明显优于Vc。

3 结论

实验表明，碧螺春茶提取物具有较强的清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、烷基自由基以及抑制油脂过氧化的能力，清除率与样品浓度呈正相关，这与碧螺春茶中所含多酚类和多糖类等活性物质的种类有关。实验结果也进一步证实了碧螺春茶具有较好的减少心血管疾病、减缓衰老等保健功能。碧螺春茶抗氧化的具体有效成分及分子机理有待更进一步的研究。

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