超声波法提取益母草中多糖方法的研究

张金生，杨宏娟，李丽华，赵文涛，蔚永清

（1.辽宁石油化工大学化学与材料科学学院，辽宁抚顺 113001；2.辽宁石油化工大学石油化工学院，辽宁抚顺 113001）

益母草（Leonurus Japonicus Houtt），别名茺蔚、坤草，是一种草本植物，以花蕾期的地上部分的干品或鲜品入药，有活血调经，祛瘀生新，利尿消肿等功效，临床多用于月经不调、胎漏难产、痛经及产后瘀血腹痛，素有“血家圣药”、“经产良药”之称[1]。目前对益母草中化学成分研究较多的主要是生物碱、二萜类、阿魏酸类、挥发油类等[2]。而对益母草多糖研究较少，多糖（polysaccharide）是构成生命的四大基本物质之一，多糖在增强免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面发挥着生物活性作用[3]。因此，随着多糖的制备、合成、食品科学及药理学研究的不断深入，多糖的应用将具有更广阔的前景[4]。本试验优化了益母草多糖的提取工艺，以其为更好的利用益母草提供参考。

1 材料和仪器

1.1 实验原料和试剂

益母草：采自抚顺市千金乡。乙醇、葡萄糖、正丁醇、氯仿、浓硫酸、苯酚等均为分析纯试剂。

1.2 仪器

超声波清洗器：天津市琛航科技仪器有限公司；可见分光光度计：上海达平仪器有限公司；远红外辐射干燥箱：上海阳光实验仪器有限公司；低速离心机：北京医用离心机厂。

2 方法

2.1 超声波提取益母草多糖

称取1 g益母草粉末，放入锥形瓶中，利用超声波提取，冷却，布氏漏斗过滤，弃去滤渣，用旋转蒸发仪使滤液浓缩，用Savage法除蛋白，向浓缩液中加入氯仿和正丁醇的混合液（体积比为4∶1），反复强烈振荡，直到在280 nm处没有紫外吸收峰为止，加入3倍体积的95%乙醇溶液，静置过夜，4000r/min离心20 min，无水乙醇、丙酮洗涤至无色，烘干，得益母草粗多糖。

2.2 样品多糖含量的测定

本实验采用苯酚－硫酸法测定多糖含量。称取样品多糖5mg至50mL的容量瓶中配置成0.1mg/mL的多糖溶液，按照2.1的方法测其吸光度值，并通过运用线性回归方程计算其对应的多糖浓度，进而利用多糖的计算公式求出多糖的得率。计算公式如下：

式中:C为多糖质量浓度，（mg/mL）；D为稀释倍数；V为体积，mL；M为多糖的总质量，mg；m为配制样品溶液的多糖质量，mg；W为原药材质量，g。

3 结果与讨论

3.1 标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的葡萄糖0.100 2 g，加蒸馏水定容在100 mL的容量瓶中，分别移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至25 mL的容量瓶中，加入蒸馏水至刻度摇匀，再分别移取1 mL于具塞试管中，加入1 mL 6%的苯酚，并迅速滴加浓硫酸6 mL，沸水加热30 min，冷却至室温，同时用蒸馏水做空白试验。在492 nm处测定吸光度A，以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，可得回归方程为：y=0.124x-0.006 4，R2=0.999 6。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of the glucose

3.2 超声波法提取益母草中多糖的单因素试验

3.2.1 提取时间对多糖提取率的影响

称取益母草样品0.5 g，料液比为1∶15（g/mL），温度35℃，提取益母草多糖时间分别为5、10、15、20、25 min，结果如图 2 所示。

图2 提取时间对多糖得率的影响Fig.2 Effects of the extraction time on extraction rate

由图2可知，多糖得率随着提取时间增长而增大，当时间达到15 min时得率最大，之后时间越长得率反而减少，这可能是由于长时间的超声提取不能使多糖完全溶出，但由于超声波对多糖的机械效应，时间过长会破坏多糖的结构，影响多糖的得率。

3.2.2 料液比对多糖提取率的影响

称取益母草样品 0.5 g，料液比为 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），温度 35 ℃，提取益母草多糖15 min，结果如图3所示。

图3 料液比对多糖得率的影响Fig.3 Effects of the solid to liquid on extraction rate

由图3可知，多糖的得率随着料液比的增大而增加，当料液比达到 1∶15（g/mL）时得率最大，之后料液比越大多糖得率反而下将。可能是溶剂量过小时，多糖溶出不完全；溶剂量过大时，超声波辐射又被溶液大量吸收，不能完全作用于物料，从而影响多糖提取率[5]。

3.2.3 温度对多糖提取率的影响

称取益母草样品 0.5 g，料液比为 1∶15（g/mL），温度 15、25、35、45、55 ℃，提取益母草多糖 15 min，结果如图4所示。

图4 提取温度对多糖得率的影响Fig.4 Effects of the extraction on extraction rate

由图4可知，多糖得率随着温度的升高而增大，当温度达到55℃时多糖得率最大，之后随着温度继续增高得率反而减少，可能是由于植物多糖不易溶于低温的水，而温度过高会使多糖水解变质，从而影响得率。

3.3 正交试验设计及结果分析

为了优化提取工艺，本试验通过对单因素的考察，选择了对提取率影响较大的3个因素：提取时间（A）、料液比（B）、反应温度（C），进行三因素三水平的正交试验。由多糖得率为试验指标来确定最佳的提取工艺。正交试验因素水平如表1，正交试验结果如表2。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

由表2中的极差分析可知，影响益母草多糖得率的顺序为B＞A＞C，即料液比＞提取时间＞提取温度。由正交试验结果可知最佳的提取工艺条件为A2B2C2，即提取时间为 15 min，料液比为 1∶15（g/mL），提取温度为35℃。

表2 正交试验结果及直观分析Table 2 The test resulst and the visual analysis of the orthogonal test

3.4 最佳工艺条件的验证

按A2B2C2组合进行5次平行试验，提取率为3.24%。再按A3B2C3组合进行5次平行试验，提取率为3.11%。由此可知，超声波法提取益母草中多糖最佳的提取工艺为A2B2C2，即提取时间为15 min，料液比为 1∶15（g/mL），提取温度为 35 ℃。

3.5 稳定性试验

称取1 mL的样品溶液，按2.1法每隔半个小时（30 min）测定一次吸光度，结果如表3所示，RSD为0.34%。

表3 稳定性试验结果Table 3 The test results of the stability

3.6 精密度试验

称取1 mL相同的样品溶液5份，按2.1法测得样品的吸光度值，结果如表4所示，其RSD为0.39%。

表4 精密度试验结果Table 4 The test results of the precision

3.7 加标回收率试验

精密称取益母草粗多糖5份，加入与测得多糖的含量相近的葡萄糖粉末，按2.1法得样品的吸光度值，计算出平均加标回收率为93.04%，RSD为2.03%，结果如表5所示。

表5 加标回收率试验结果（n=5）Table 5 The test results of the recovery（n=5）

4结论

采用超声波法提取益母草多糖并通过正交试验设计优化益母草多糖的提取工艺，其最佳提取工艺为提取时间15 min，料液比1∶15，提取温度35℃，在最佳工艺条件下的提取率为3.24%。比文献[6]报道益母草多糖的提取率低了1.62%，但是提取时间缩短了7倍。由于益母草价格低廉、易得，同时具有一定的药理作用，且此方法方便、简单快捷、不引进杂质，为益母草的进一步开发利用提供了参考。

采用苯酚－硫酸法测定益母草中多糖的含量，根据多糖在有浓硫酸的条件下先水解成单糖，同时迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成糖醛衍生物，此物质在波长480 nm～490 nm处吸光度值与糖浓度呈一定的线性关系，从而得出多糖浓度。此方法的试剂易得、简便快捷，同时益母草多糖在此法显色后3 h内稳定、回收率高。

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[1]安伟建.中药益母草有效成分提取和测定方法的研究进展[J].天津药学,2003,15(3):68－70

[2]范美华,王健鑫,李鹏,等.益母草的研究进展[J].中国药物与临床,2006,6(7):528－530

[3]周萍,王成军,张海珠.西归中多糖的提取及含量测定[J].时珍国医国药,2010,21(9):2210－2211

[4]贾亮亮,袁丁,何毓敏,等.多糖提取分离及含量测定的研究进展[J].食品研究与开发,2011,32(3):189－192

[5]禹文峰,任风莲,吴晓斌.百合多糖的超声波提取工艺研究[J].广州化学,2007,32(2):36－40

[6]蔡文燕,吴水金,蔡欣.益母草多糖提取工艺的研究[J].热带农业科学,2008,28(6):39－42