大孔树脂纯化车前草多酚的研究

刘春明，王强，杨帆，胡杨

（长春师范学院中心实验室，吉林长春 130032）

车前草是车前科车前属（Plantago）车前Plantago asiaticalL的干燥全草[1]。车前草多酚从车前草中提取的天然植物多酚类活性化合物，这类化合物含有酚羟基基团，具有抗氧化、清除体内自由基的能力、延缓衰老的能力，是一类极具开发价值的天然产物[2-4]。因此，寻找一种高效、实用的提取、纯化工艺是进一步开发车前草多酚的主要环节。

大孔树脂是一种有机高分子聚合物，具有比表面积大、吸附容量大、选择性好、再生处理方便等诸多优点[5]，近年来，在植物中多酚化合物的纯化应用越来越多，如茶多酚[6]、苹果多酚[7]、葡萄多酚[8]等。本文采用大孔树脂对车前草多酚进行了分离纯化。以期建立大孔树脂分离纯化车前草多酚的分离纯化工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

车前草采于吉林市左家，经长春中医药大学邓名鲁教授鉴定为车前科植物车前Plantago asiatica L.车前科植物车前的干燥全草。

1.2 仪器与试剂

DU800紫外可见分光光度计：美国BECKMAN COULTER公司；ALPHA2-4 LSC真空冷冻干燥机：德国CHRIST公司；3K30台式冷冻离心机、没食子酸：德国Sigma公司；大孔树脂：天津南开大学化工厂；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 车前草多酚提取液的制备

准确称取车前草粗粉500 g，加入70%乙醇回流提取3次，每次4 000 mL，每次1 h，滤过，合并滤液，回收乙醇，残渣加水溶解至1 000 mL（0.5 g药材/mL），离心，备用。

1.2.2 车前草多酚含量测定方法

1.2.2.1 酒石酸亚铁溶液的配制

准确称取FeSO4·7H2O 1 g，酒石酸钾钠5 g，加蒸馏水溶解后，转移至容量瓶，用蒸馏水定容至1 000 mL，避光保存。

1.2.2.2 pH为7.5的磷酸缓冲液的配制

准确称取 Na2HPO4·12H2O 60.2 g，NaH2PO4·2H2O 5 g，加蒸馏水溶解后，转移至容量瓶，加蒸馏水定容至1000 mL，冷藏。

1.2.2.3 标准曲线的制备

精密称取没食子酸标准品500 mg，用蒸馏水溶解定容至50 mL。吸取5 mL，用蒸馏水稀释至10 mL容量瓶，得到5 mg/mL的标准溶液，分别吸取 80、120、160、200、240、280 μL 标准溶液置于 25 mL 容量瓶中，加蒸馏水4 mL，酒石酸铁溶液5 mL，摇匀，再加入pH为7.5的磷酸缓冲溶液稀释至刻度，用蒸馏水代替标准品溶液加入同样试剂作空白，于540 nm波长测定吸光度值。以浓度c为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为浓度c和吸光度值A的关系：A=15.335c-0.054 9，r=0.999 8，在 0.016 mg/mL～0.056 mg/mL范围内，浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.2.4 样品含量的测定

从样品溶液中量取1 mL，按照标准曲线项下方法于540 nm处测定吸光度，从标准曲线上读出浓度值即可。

1.2.3 树脂的预处理

取大孔树脂加乙醇浸泡至充分溶胀，用乙醇洗涤至加蒸馏水无浑浊，再用蒸馏水洗涤至无醇味，备用。

1.2.4 静态吸附实验

量取湿树脂10 mL置于250 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL车前草多酚提取液，置于振荡器中，25℃，120 r/min振荡2 h，放置过夜，充分吸附后，从上清液中取样，测定多酚含量。根据公式计算树脂静态吸附量：

吸附量（mg/mL）=（C0-C）V/G

式中：C0、C 为吸附前后车前多酚的含量，（mg/mL）；V为供试液体积，mL；G为树脂量取量，mL。

1.2.5 静态解吸实验

将10 mL充分吸附的树脂过滤，用水冲洗后滤干，置于具塞锥形瓶中，加入95%的乙醇水溶液50 mL，密封置于振荡器中，25℃，120 r/min振荡，解吸一定时间后，从上清液中取样，测定多酚含量。根据公式计算静态解吸率：

解析率（%）=C×V×100/W

式中：C为洗脱液多酚浓度，（mg/mL）；V为洗脱液总体积，mL；W为吸附总量，mg。结果表明静态解吸率为71.60%。

1.2.6 动态吸附实验

树脂湿法装柱（内径1.2×30 cm），柱高11.5 cm，以1 mL/min的流速加入车前多酚含量为3.972 mg/mL的供试液20 mL，吸附饱和后，树脂柱用蒸馏水洗涤至用苯酚硫酸法检测至无糖，以去除树脂吸附的糖和水溶性杂质，然后用洗脱液洗至无色为止。

2 结果与分析

2.1 静态试验

2.1.1 树脂种类的选择

选用 AB-8、DA201、D101、DM301 4 种大孔树脂对车前草多酚进行静态吸附试验，结果见图1。

图1 树脂对车前草多酚的静态吸附量Fig.1 Amount of static adsorption of different types of resin for Plantago asiatic

由图1可知，吸附达到平衡后，4种树脂均可吸附多酚物质，说明大孔树脂对多酚物质的吸收具有选择性，其中弱极性树脂D101和AB-8对多酚的吸附能力较强，中极性树脂DM301和极性树脂DA201吸附能力较弱，为进一步选定树脂种类，对AB-8和D101进行静态解吸试验，结果见图2。

图2 树脂对车前草多酚的静态解吸曲线Fig.2 Static desorption curves of different types ofresin for Plantago Asiatic polyphenols

由图2可知，D101树脂在2 h内基本达到解吸平衡，解吸率为81.6%；AB-8树脂在2.5 h内基本达到解吸平衡，解吸率为79.8%，多酚类物质基本被洗脱下来。因此选用D101型树脂对车前多酚提取物进行纯化。

2.1.2 静态吸附时间的确定

图3为D101树脂静态吸附曲线。

图3 D101树脂静态吸附曲线Fig.3 Static adsorption curves of D101 resin

从吸附曲线上得知，吸附2 h后，车前草多酚浓度不再减少，大孔树脂达到吸附达到平衡。因此，吸附时间选择在2 h。

2.2 动态试验

2.2.1 上样速度的考察

树脂湿法装柱，粗提液以不同的流速上样，使样品动态吸附，计算吸附量。图4显示了不同的上样速度对吸附率的影响。

图4 供试液车前多酚上样速度对吸附效果的影响Fig.4 The influence of the content of the Plantago Asiatic polyphenols on the adsorption

上样速度慢，有利于树脂对多酚类化合物的吸附，流速过快，溶液中的多酚物质会来不及吸附到树脂的内表面，就被冲出柱子，导致吸附量降低。但流速低会影响到生产效率，延长生产周期。由图4可知，在2 BV/h、3 BV/h两种上样速度，树脂吸附性能相差不大，优于4 BV/h的情况。因此，上样速度选择3 BV/h。

2.2.2 洗脱剂浓度的考察

树脂湿法装柱，将车前草粗提液装入树脂柱中，进行吸附，再用蒸馏水洗涤至流出液无色。然后分别用10%、30%、50%、70%、90%乙醇进行洗脱，分别测定洗脱液中多酚含量，绘制洗脱曲线见图5。

图5 乙醇浓度对解吸效果的影响Fig.5 Effect of EtOH concentration on desorption rate

选择曲线最高点作为洗脱浓度，由洗脱曲线可知，选择30%乙醇作为车前草多酚的洗脱溶剂。

2.2.3 洗脱流速的考察

树脂湿法装柱，车前草粗提液以3 BV/h速度上样，吸附2 h后，先用蒸馏水洗脱至无色，再分别用乙醇溶液以不同速度洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总多酚的量，计算洗脱效率，结果见图6。

图6 洗脱速度对解吸率的影响Fig.6 The influence of elution speed on the adsorption rate of Plantago Asiatic polyphenols

从图6可以看出，洗脱速度为2 BV/h与4 BV/h时洗脱率较好，洗脱率相差不大，考虑到实际生产，洗脱速度慢，时间长，因此选择4 BV/h进行洗脱。

3 结论

在D101大孔树脂对车前草多酚的分离纯化中，当供试液的车前草多酚含量为3.972 mg/mL，以30%乙醇作为洗脱剂，进样速度为3 BV/h，吸附时间为2 h，洗脱速度为4 BV/h时，车前草多酚纯度由原来的3.07%提高到17.36%，纯度提高了近5倍。说明D101大孔树脂发纯化车前草多酚虽然能使其纯度得到了一定的提高，但还不够理想，若想得到纯度更高的的车前草多酚还要结合其他的分离纯化方法。

车前草作为药食同源的中药材，近几年，其综合利用价值逐渐引起人们的重视，除作药用外，在保健食品中也得到广泛的应用，目前已开发出了一些新产品，如车前草可溶性膳食纤维、保健饮料等。而对车前草中具有抗氧化、抗衰老作用的多酚类成分的研究还不够深入[6-7]。本研究对车前草多酚的开发研究具有重要意义。

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