葛花总黄酮的含量测定及体外抗氧化作用研究

欧阳昌汉，张瑞雪，叶涛，吴基良

（1.咸宁学院药学院，湖北咸宁 437100；2.华中农业大学，湖北武汉 430070）

自由基系指外层轨道含有未配对的电子、原子团或特殊状态的分子。由于自由基可引起细胞损伤和死亡，与衰老、痴呆等某些疾病的发生有着密切关系，致使抗自由基生物学与功能食品科学的研究成为一个活跃的领域，寻找天然抗氧化剂和自由基清除剂已越来越引起人们的关注[1]。黄酮类化合物因具有抗氧化、抗炎、镇痛、降脂作用而成为近年来的研究热点；对富含黄酮化合物的中草药进行筛选，将为天然抗氧化剂的开发提供参考。

葛花为豆科植物野葛 [Pueraria Lobata（Willd.）Ohwi]的干燥花蕾，是药食同功的保健美食，具有解酒护肝、抗肿瘤、降糖之功效，为我国民间用于解酒的传统中药，亦是目前许多解酒保健品成分之一，其主要有效成分为黄酮类化合物[2-4]。目前有关葛花中总黄酮的提取方法已有报道，但其存在提取时间长、溶剂消耗大、提取率低等缺点[5]。为此，将超声技术用于葛花中总黄酮的提取，同时对黄酮提取物进行含量测定及体外自由基清除研究，进而为更好地开发和利用葛花中黄酮类物质提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

葛花：江西横峰葛源绿山葛粉厂，经我院药用植物教研室鉴定为豆科蝶形花亚科葛属植物野葛的干燥花蕾；芦丁标准品：中国药品生物制剂鉴定所，批号：0080－9504；1，1，－二苯基苦基苯阱（DPPH）、2，2′－联氨－双（3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸）二胺盐（ABTS）：美国Sigma公司产品，其余试剂为国产分析纯。

1.2 主要仪器

SB－5200超声波清洗仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；50－Conc紫外可见分光光度仪：美国VARIAN公司；RE－5299旋转蒸发仪：巩义市英峪予华仪器厂；TDL－5台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 葛花中总黄酮提取方法

精确称取干燥葛花粉末10 g，置于500 mL烧杯中，加入适量浓度甲醇300 mL，超声波辅助提取一段时间，提取液过滤。滤渣反复提取3次，合并3次滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至一定体积，4 000 r/min离心15 min，吸取上清液进行脱脂、去糖、弃蛋白，即得样品液。

1.3.2 葛花中总黄酮提取条件研究

采用正交设计方法，以甲醇为溶剂，选择提取温度、溶剂浓度、提取时间和料液比4个因素，采用L9（34）正交设计，进行四因素三水平试验，对葛花中总黄酮提取条件进行优化，因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平表Table 1 Orthogonal test level-factor table

1.3.3 标准曲线制备

准确称取5.25 mg芦丁标准品，用90%乙醇配制成浓度为0.021 mg/mL芦丁标准液。分别移取芦丁标准液 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，90%乙醇定容至刻度。在200 nm～400 nm波长段进行紫外扫描，于最大吸收波长265 nm紫外光下测定吸光度，绘制标准曲线。

1.3.4 样品总黄酮含量测定

吸取超声提取后的葛花上清液1 mL，离心，取上清液0.1 mL，用90%的乙醇稀释50倍。以90%乙醇作为空白对照，在265 nm波长紫外光下，用1 cm石英比色皿测定吸光度，然后由标准曲线计算出待测葛花样品中总黄酮含量。

1.3.5 总抗氧化能力测定

参照文献方法[6]，取已稀释过的ABTS·+储藏液1.2 mL，加入不同浓度葛花总黄酮溶液0.1 mL，反应时间为6 min，在734 nm处测定其吸光度。

清除率SA/%=（Ao－As）/As×100。

1.3.6 DDPH清除率测定

取DPPH溶液1.5 mL，加入不同浓度的葛花总黄酮溶液1.5mL，摇匀，在25℃避光放置30min，以1.5mL 90%乙醇与1.5 mL水混合液调零，在最大吸光波长517 nm处测定其吸光度。用1.5 mL无水乙醇代替样品液，得到吸光度为A；用1.5 mL无水乙醇代替DPPH溶液，得到吸光度为Aj。清除率SA/%=[A0－（As－Aj）]/A0×100。

1.3.7 超氧阴离子清除率测定

取 50 mmol/L Tris－HCl缓冲液（pH=8.2）2.5 mL，加入不同浓度葛花总黄酮溶液0.4 mL，25℃水浴保温10 min，加入5 mmol/L邻苯三酚溶液0.1 mL，混匀后立即倒入比色杯，于特征波长320 nm处每隔30 s测定邻苯三酚溶液3 min内吸光度变化。以吸光度对时间进行线性回归处理，测定邻苯三酚自氧化速率。清除率 SA/%=（As－A0）/A0×100。

1.3.8 NO清除率测定

在反应体系中加入10 mmol/L硝普钠0.5 mL，PBS缓冲液（pH=7.4）0.5 mL，不同浓度的样品溶液0.5 mL，于25℃环境中放置反应180 min，然后取反应液1 mL，依次加入Griess反应试剂，混匀后在25℃反应30 min，以0.5 mL无水乙醇与1.5 mL水混合调零，在540 nm下测量吸光度。用1.5 mL无水乙醇代替样品液，得到吸光度为A0；用1.5 mL无水乙醇代替硝普钠溶液，得到吸光度为Aj。清除率SA/%=[A0－（As－Aj）]/Ao×100。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制及样品含量测定

以吸光度（y）为纵坐标，芦丁质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，见图1。

图1 芦丁的标准曲线Fig.1 Standard curve of the absorption capacity of rutin

进行统计处理，得回归方程：y=30.812x+0.001 7，R2=0.999 9，说明芦丁在所取的浓度范围内其浓度和吸光度呈良好的线性关系。

2.2 超声提取正交试验结果与分析

从直观分析表看出，在所选取的四个因素内，极差大小顺序是D＞C＞B＞A；D的极差最大，反映为当D因素水平变动时，对提取产率的影响最大，A因素对提取产率的影响最小。分析均值k可以得到各因素的较优水平是：A2，B2，C3，D3：即使用浓度为 50%甲醇溶液，料液比为1∶30（g/mL），在70℃温度下，超声2.0 h为葛花提取的最佳方案，见表2。

表2 L9（34）正交试验设计与极差分析结果Table 2L9（34）orthogonal experiment design and result analysis

以因素A作为误差项，方差分析结果表明，因素C和因素D对提取产率的影响较为显著（P＜0.05），而因素A和因素B影响不明显（P＞0.05），这与极差分析得出的结果相一致，提示提取时间和提取温度对葛花中黄酮提取影响较为显著。在上述最佳提取条件下，葛花总黄酮的平均提取产率为17.48%。

2.3 葛花总黄酮的总抗氧化能力

ABTS·+经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色水溶性ABTS·+自由基，当向其中加入抗氧化物质时，则该物质会与ABTS·+发生反应而使反应体系褪色，在ABTS·+自由基的最大吸光波长下检测吸光度的变化，即可换算出被测物质总的抗氧化能力。当吸光值越低时，表示样品对ABTS·+的清除能力越强，见图2。

图2 葛花总黄酮的总抗氧化能力Fig.2 The total antioxidant capacity of total flavonoids from Puerariae Flos

如图2可见，葛花总黄酮的总抗氧化能力随着黄酮质量浓度的增加，抗氧化能力逐渐增强，表明总黄酮抗氧化能力与黄酮质量浓度有明显的量效关系。在实验条件下，当葛花总黄酮质量浓度为600 μg/mL时，清除率可达83.26%。

2.4 葛花总黄酮清除DPPH作用

DPPH在有机溶剂中是一种较为稳定的自由基。当抗自由基活性物质与其作用时，通过与其孤对电子配对，致使其吸收峰消失或减弱。因此通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性，见图3。

图3 葛花总黄酮对DPPH的清除作用Fig.3 DPPH radical scavenging activity of total flavonoids from Puerariae Flos

从图3可以看出，葛花总黄酮与VC对DPPH都有明显的清除作用，并且随着质量浓度的增加，清除能力增强，表明葛花总黄酮与VC对DPPH的清除能力与浓度有明显的量效关系。在实验条件下，当葛花总黄酮质量浓度为400 μg/mL时，DPPH的清除率可达71.62%，提示葛花总黄酮对DPPH自由基具有较强清除作用。

2.5 葛花总黄酮清除超氧阴离子作用

在弱碱性条件下，邻苯三酚自身氧化分解产生O2-·，随着反应持续进行，O2-·在体系中不断积累，导致反应液在320 nm处的吸光度随时间而线性增大，因此，测定吸光度随时间的变化率，并与空白液对比可得到被测物抑制O2-·积累的作用能力，见图4。

图4 葛花总黄酮对O2-·的清除作用Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of total flavonoids from Puerariae Flos

从图4可以看出，葛花总黄酮对邻苯三酚自氧化产生的O2-·具有一定的清除作用，且随着黄酮质量浓度的增加其清除率逐渐上升。在实验条件下，当葛花总黄酮质量浓度为1 200 μg/mL时，O2-·的最大清除清除率可达37.97%，提示葛花总黄酮对O2-·具有一定的清除作用。

2.6 葛花总黄酮清除NO作用

葛花总黄酮清除NO作用，见图5。

图5 葛花总黄酮对NO自由基的清除作用Fig.5 Nitric oxide radical scavenging activity of total flavonoids from Puerariae Flos

从图5可以看出，葛花总黄酮对NO自由基具有一定的清除作用，并且随着黄酮质量浓度的增加其清除率逐渐上升。在实验条件下，当葛花总黄酮质量浓度为1200μg/mL时，NO自由基的清除率可达56.24%，提示葛花总黄酮对NO自由基具有清除作用。

3 结论

1）超声辅助提取葛花中黄酮的最佳工艺条件为：50%甲醇溶液，料液比为 1∶30（g/mL），在 70℃温度下，超声2.0 h，葛花总黄酮的提取率为17.48%。

2）葛花总黄酮对DPPH、O2-·和NO自由基均具有清除作用，而且与黄酮的浓度成正相关性。当浓度达600 μg/mL时，总抗氧化能力可达83.26%；当黄酮浓度为400 μg/mL时，DPPH清除率可达71.62%，提示葛花总黄酮在人类保健事业上有潜在的利用价值，也为其进一步的研究和开发利用提供理论参考。

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