电压敏感染料DiBAC4(3)用于检测胚胎细胞膜电位变化的研究*

丁晓燕,方廖琼,张 弘,乔 海,王智彪

(重庆医科大学生物医学工程系,省部共建超声医学工程国家重点实验室,超声医学工程重庆市市级重点实验室,重庆 400016)

胚胎早期分化的机理是当今生命科学领域中的重要基础性课题之一,因推测其与肿瘤形成的机理相关,故倍受关注,然而目前尚无定论[1]。在研究胚胎分化或其他相关生命活动时,如判断早期胚胎质量,需要测量其膜电位的变化作为指标。虽然膜电位测定仪在测量膜电位方面的应用已经比较成熟[2],但其用于胚胎细胞时需用酸性台氏液除去透明带,很容易伤害胚胎细胞导致结果不准确,且技术水平要求较高、操作复杂,因此用膜电位测定仪测量胚胎细胞的膜电位有一定的局限性。

电压敏感染料的出现给观测胚胎细胞膜电位的变化提供了一种可能的、操作简便且不破坏细胞结构的方法。DiBAC4(3)是一种膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料[3],由于它的负离子特性,它会随着细胞膜电位的变化进出细胞膜从而保持膜内外电荷的动态平衡。

DiBAC4(3)已经被用于很多微需氧微生物的研究,其中包括肠贾第鞭毛虫、阴道毛滴虫、胎儿三毛滴虫、六鞭毛虫[4]。但目前尚未见DiBAC4(3)用于胚胎细胞的研究,由于DiBAC4(3)是亲脂性染料,易与蛋白结合[5],而在囊胚期以前的胚胎被主要成分是糖蛋白的透明带包裹,所以用DiBAC4(3)给胚胎细胞染色时可能会受到透明带的影响,而无法准确检测细胞膜电位的动态变化。本实验选取囊胚期以前的三个时期的胚胎,对DiBAC4(3)检测细胞膜电位动态变化的可行性进行研究,为胚胎的膜电位检测探索新的技术方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

性成熟昆明小鼠购于重庆医科大学实验动物中心。雌鼠6～8周龄,体重25～30 g;雄鼠8～10周龄,体重30～35 g。饲养条件为自由摄食、饮水,12 h光照,环境温度18℃～22℃,相对湿度60%～80%。雌鼠超排卵(腹腔注射孕马血清PMSG 7.5单位/只48 h后腹腔注射兽用绒毛膜促性腺激素HCG 7.5单位/只)后与雄鼠1∶1合笼,次日晨发现有阴栓者为妊娠第一天(D1)孕鼠。

1.2 药品和试剂

PMSG(宁波第二激素制品厂),HCG(丽珠制药公司),DiBAC4(3)(Molecular Probes,Eugene,OR)溶于DMSO(美国Sigma公司),配制成1 mmol/L储备液并分装,用Ham's F12/DMEM液体培养基(Hyclone公司)稀释成终浓度为10 μ mol/L溶液待用。KCL溶于Ham's F12/DMEM配成浓度500 mmol/L溶液。M2和M16(EmbryoMax,MR-015P-5F)。

1.3 仪器设备

一次性无菌培养皿(Corning,America),TC2323型二氧化碳孵箱(Shel-Lab,America),LX70型倒置显微镜(Olympus,Japan),SZX12型体视显微镜(Olympus,Japan),激光共聚焦显微镜(Leica,Germany)。

1.4 胚胎细胞的准备

分别取D1、D2孕鼠,脱颈处死,75%酒精常规消毒,开腹后剪取双侧输卵管,放入加有DMEM/F12培养基的培养皿中,在体视显微镜下剥离输卵管壶腹部后,挑选发育形态正常的单细胞、二细胞期胚胎。取D3孕鼠,75%酒精常规消毒,开腹后剪取双侧子宫,放入加有DMEM/F12培养基的培养皿中,用注射器冲洗子宫数遍后,在体视显微镜下挑选发育形态正常的囊胚。将取得的胚胎细胞用FD冲洗后吸入M2液滴中,于37℃、5%CO2、相对湿度为95%～100%的孵箱中孵育5 min后,分成两组(实验组与对照组)放入M16中于温箱中孵育30 min。

1.5 孵育和染色

M16中孵育30 min后在实验组和对照组中分别加入DiBAC4(3)至终浓度为 5μ mol/L,5 min时在荧光显微镜下观察染色情况,后每隔10 min在荧光显微镜下观察一次。

1.6 KCL去极化

加DiBAC4(3)30 min后在实验组中加入500 mmol/L的KCL溶液至终浓度为100 mmol/L,即刻在荧光显微镜下观察荧光强度的变化,后每隔5 min观察一次;对照组中同时加与KCL等体积的M16,即刻在荧光显微镜下观察荧光强度的变化,后每隔5min观察一次。

2 结果

2.1 胚胎细胞的染色情况

在激光共聚焦显微镜下可以清晰地看到,胚胎细胞成绿色荧光(图1 a),而透明带未被染色(图1 c),DiBAC4(3)可以透过胚胎的透明带进入胚胎细胞内(图1见彩图页Ⅱ)。

2.2 胚胎细胞去极化时荧光强度的变化

实验组在加入KCL后,胚胎细胞发生去极化,即刻胚胎细胞的荧光强度显著增加(图2 a,b),对照组胚胎的荧光强度无显著变化(图2 c,d,图2见彩图页Ⅱ)。激光共聚焦显微镜显示在加入KCL之前的30 min内,实验组与对照组的荧光强度随时间逐渐增大,加入KCL之后,实验组荧光强度显著增加,而对照组无明显变化(图3)。

Fig.3 Comparison of fluorescence intensity changes between the experiment group and control group(The value of fluorescence intensity was given by laser scanning confocal microscope)

2.3 不同发育阶段的胚胎细胞染色比较

分别将单细胞期、二细胞期和囊胚期的胚胎细胞的染色情况进行比较,发现不同时期的胚胎细胞均可以被DiBAC4(3)染色,且在加KCL去极化即刻均有显著的荧光强度的变化(图4见彩图页Ⅱ)。

3 讨论

生物电现象是一种普遍存在而又十分重要的生命现象。细胞的生物电现象主要有两种形式:一种是安静(未受刺激)时所具有的静息电位,另一种是受刺激时产生的动作电位。本实验采用KCL对胚胎细胞进行刺激使其产生动作电位,加KCL后由于细胞膜内外的钾离子平衡的改变导致细胞发生去极化,使细胞内的电位升高,而DiBAC4(3)染料分子受正电位的影响会由膜外迅速进入到膜内引起荧光强度的瞬间增强,并在一段时间内与细胞质中的蛋白质结合而引起细胞内荧光强度的缓慢增强[5]。实验结果显示胚胎细胞的染色不受透明带的影响,可能原因为透明带中的糖蛋白为小分子蛋白,不会大量积聚染料而造成细胞染色的失败。

分别将单细胞期、二细胞期和囊胚期的胚胎细胞的染色情况进行比较,发现不同时期的胚胎细胞均可以被DiBAC4(3)染色,且在加KCL去极化即刻均有显著的荧光强度的变化,说明DiBAC4(3)可以用于检测单细胞期、二细胞期及囊胚期胚胎膜电位的动态变化。同时实验结果表明同一胚胎期的不同胚胎细胞、不同胚胎期的细胞、同一胚胎期的内层细胞与外层细胞染色存在一定差异,这可能与它们的膜电位不同有关,有研究推测这种膜电位的差别正是胚胎细胞发生分化的诱因[1]。

本研究通过观察KCL使单细胞期胚胎、二细胞期胚胎、囊胚期胚胎去极化膜电位变化时,相应的DiBAC4(3)染色后荧光强度的变化,证明了电压敏感染料DiBAC4(3)可以用于检测胚胎细胞膜电位的动态变化。

[1]穆 祥,杨佐君,倪和民,等.小鼠早期胚胎细胞膜电位的测定及胚胎早期分化诱因的探讨[J].北京农学院学报,2004,19(4):29-33.

[2]Brauner T,Hülser D F,Strasser R J.Comparative measurements of membrane potentials with microelectrodes and voltage-sensitive dyes[J].Biochim Biophys Acta,1984,771(2):208-216.

[3]Wilson H A,Chused T M.Lymphocyte membrane potential and Ca2+-sensitive potassium channels described by oxonol dye fluorescence measurements[J].J Cell Physiol,1985,125(1):72-81.

[4]Bankers-Fulbright J L,Gleich G J,Kephart G M,et al.Regulation of eosinophil membranedepolarization during NADPH oxidase activation[J].J Cell Sci,2003,116(pt 15):3221-3226.

[5]Epps D E,Wolfe M L,Groppi V.Characterization of the steady-state and dynamic fluorescence properties of the potential-sensitive dye bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol(Dibac4(3))in model systems and cells[J].Chem PhysLipids,1994,69(2):137-150.