内毒素移位在肠淋巴再灌注加剧SMAO休克大鼠多器官损伤中的作用*

2012-08-30杨丽娜赵自刚赵永泉刘争杰牛春雨

中国应用生理学杂志 2012年1期

杨丽娜,赵自刚,赵永泉,刘争杰,牛春雨,张静

(河北北方学院微循环研究所,基础医学院病理生理学教研室,张家口 075000)

研究表明,肠源性细菌内毒素经肠淋巴途径移位至全身是二次打击、失血性休克导致器官损伤的重要机制[1,2],肠淋巴液是危重病发展的桥梁[3,4]。我室以“肠缺血/再灌注”概念为基础,把“夹闭肠系膜淋巴管(mesenteric lymph duct,MLD)阻断淋巴液回流1 h,再行淋巴液灌注”称为“肠淋巴再灌注”(mesenteric lymph reperfusion,MLR);发现单纯的MLR对机体不造成损害,但可加剧肠系膜上动脉闭塞性(superior mesenteric artery occlusion,SMAO)休克这一病理过程,降低SMAO休克大鼠的平均动脉压及24 h存活率,引起远隔多器官功能障碍及组织学损伤[5],其机制与MLR加重多个器官的自由基损伤、一氧化氮释放、组织细胞膜泵功能障碍有关[6]。鉴于肠淋巴途径作为肠源性内毒素移位的关键途径[7],MLR加剧SMAO休克多器官损伤的作用机制是否与内毒素经肠淋巴途径的移位有关值得研究。为此,本文观察MLR对SMAO休克大鼠多器官内毒素(endotoxin,ET)、内毒素增敏系统、炎症介质的影响,揭示肠源性内毒素移位在MLR加剧SMAO休克多器官损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级Wistar雄性大鼠24只,体重280～330 g,购自中国军事医学科学院实验动物中心(实验动物许可证号SCXK[军]2007-004)。随机分为4组(n=6):假手术组(Sham)、MLR组、SMAO 组和 SMAO+MLR组。所有大鼠实验前禁食12h,自由饮水。实验过程中,动物的处置方法符合动物伦理学标准。

1.2 实验方法

肌肉注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg bw)麻醉大鼠后,剪毛备皮,铺消毒巾,右股部手术,股动脉插管连压力换能器接生物信号采集处理系统动态监测平均动脉血压,股静脉给予肝素钠溶液(1 ml/kg bw,即500 U/kg bw)全身抗凝;行腹部手术,暴露肠系膜根部,游离肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA),仔细分离与SMA相伴行的肠系膜淋巴管(mesenteric lymphatic duct,MLD)。在血压稳定10 min后,以无创血管夹,夹闭MLD根部1 h、松开再灌注2 h为MLR组;夹闭SMA根部1 h、松开再灌注2 h为SMAO组;同时夹闭SMA与MLD1 h、松开再灌注2 h为SMAO+MLR组;仅分离SMA、MLD,不夹闭者为Sham组。

1.3 取材与标本制备

所有动物在完成再灌注2 h后(Sham组在相当时间点),立即行腹主动脉无菌取血,置于无热源的肝素抗凝管中,3500 r/min,离心15min,取血浆封存于无热源玻璃管中,-80℃下冷冻保存。取血后迅速选择固定位置,无菌留取肝、肾、肺、心等脏器 0.3～0.5 g组织均分两份,一份加9倍的无热源水,用无热源玻璃匀浆器低温制备组织匀浆,封存于无热源玻璃管中,-80℃低温冰箱(美国热电)冷冻保存,用于检测内毒素含量;另一份加5倍的冷生理盐水,用高速分散匀质机制备组织匀浆(浓度为16.7%),封存于 EP管中,-80℃下冷冻保存,待测CD14、LBP、TNF-α含量。

1.4 内毒素检测(TAL动态浊度法)

制作标准曲线:将内毒素标准品(中国药品生物制品检定所)用检测用水稀释至终浓度为2、0.25、0.03125 EU/ml的等比系列标准溶液,分别加入已复溶的鲎试剂(TAL)反应管中,设置阴性对照管与平行管,放入已预热至37℃的内毒素检测仪(ATi 320-06,英国伯莱金耐特有限公司)的反应孔内,检测波长405 nm,预设限值 92%,得到回归方程 LgT=2.8369-0.2402LgC(T为反应时间,C为溶液中细菌内毒素浓度),r=-0.9837,阴性对照的反应时间＞3 600 s大于最低浓度的反应时间1664.5 s(图1)。将待测样本70℃水浴10 min,3 000 r/min离心10 min取上清。首先,检测不同标本从原液到最大有效稀释倍数的ET含量,根据ET回收率,确定各标本的最佳有效稀释倍数为80倍。其次,根据稀释倍数,设标本阳性对照管(加入0.25 EU/ml的内毒素标准液)与平行管,应用内毒素检测仪自动采集数据及分析,依据标准曲线,计算ET含量。整个实验在生物安全柜(美国热电)中进行无热源操作,所有与实验相关的材料或器具,均去热源。

Fig.1 Standard curve of endotoxin(ET)

1.5 各器官组织匀浆 LBP、CD14、TNF-α检测

酶联免疫(ELISA)方法测定各器官组织匀浆中LBP、CD14、TNFα含量(试剂盒由美国R&D公司生产、江苏希望生物科技有限公司代理),严格按照试剂盒说明书操作流程进行标准曲线制备、样本测定;终止反应后,将酶标板放入酶标仪(Stat Fax-2100型,美国STAT-FAX公司)槽内,选择450 nm光波长检测其OD值,绘制标准曲线后,计算各样本结果。组织匀浆蛋白定量采用考马斯亮兰法(试剂盒购自南京建成生物工程研究所)。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 MLR对SMAO休克大鼠血浆内毒素含量的影响

MLR组血浆ET含量(0.124±0.022 EU/ml)与Sham组(0.115±0.022 EU/ml)比较无显著性差异(P＞0.05);与Sham组和MLR组比较,SMAO组(0.317±0.032 EU/ml)及SMAO+MLR组(0.418±0.066 EU/ml)的血浆ET含量均显著增高(P＜0.01,P＜0.05),且SMAO+MLR组ET水平高于SMAO组(P＜0.05,图2)。

2.2 MLR对SMAO休克大鼠各器官组织匀浆ET含量的影响

MLR组肝、肺、肾、心肌组织匀浆的ET含量与Sham组比较均无显著性差异(P＞0.05);SMAO组及SMAO+MLR组肝、肺、肾、心肌组织匀浆 ET含量均显著高于Sham组和MLR组(P＜0.01,P＜0.05),且SMAO+MLR组肝、肺、肾、心肌组织匀浆ET水平高于SMAO组(P＜0.01,P＜0.05,表1)。

2.3 MLR对SMAO休克大鼠器官组织匀浆LBP、CD14含量的影响

MLR组肝、肺、肾、心肌组织匀浆 LBP、CD14含量与Sham组无明显差异(P＞0.05);SMAO组及SMAO+MLR组肝、肺、肾、心肌组织匀浆的LBP、CD14含量均显著高于Sham组与MLR组(P＜0.01,P＜0.05),且 SMAO+MLR组肝、肺、肾、心肌组织匀浆的CD14水平均显著高于SMAO组(P＜0.01,P＜0.05,表 2,3)。

Fig.2 Effect of MLR on ET content of plasma in SMAO shock rats(EU/ml, ±s,n=6)

2.4 MLR对SMAO休克大鼠器官组织匀浆TNF-α含量的影响

MLR组肝、肺、肾、心肌组织匀浆 TNF-α含量与Sham组无明显差异(P＞0.05);SMAO组及SMAO+MLR组肝、肺、肾、心肌组织匀浆的TNF-α含量均显著高于Sham组与MLR组(P＜0.01,P＜0.05),且SMAO+MLR组肝、肺、肾、心肌组织匀浆的TNF-α水平均显著高于SMAO组(P＜0.01,P＜0.05,表4)。

Tab.1 Effect of MLR on ET contents of homogenate in SMAO shock rats(EU/ml,±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 0.240±0.058 0.200±0.016 0.151±0.025 0.292±0.063 MLR 0.373±0.049 0.244±0.035 0.188±0.040 0.381±0.082 SMAO 0.645±0.059**## 0.662±0.044**## 0.494±0.083**## 0.595±0.090**#SMAO+MLR 0.728±0.088**##△ 0.892±0.154**##△△ 0.585±0.072**##△ 0.746±0.142**##△

Tab.2 Effect of MLR on CD14 contents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g, ±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 1.008±0.123 3.299±0.443 1.237±0.250 1.739±0.463 MLR 1.180±0.093 3.206±0.465 1.355±0.290 1.851±0.385 SMAO 1.521±0.346*# 3.926±0.214*# 1.572±0.453**## 2.794±0.541**##SMAO+MLR 1.921±0.265**##△ 4.223±0.465**##△ 2.182±0.519**##△△ 3.040±0.474**##△

Tab.3 Effect of MLR on LBP contents of homogenate in SMAO shock rats(mg/g,±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 0.964±0.079 0.812±0.183 0.387±0.082 0.538±0.066 MLR 1.058±0.164 0.831±0.195 0.444±0.093 0.668±0.033 SMAO 1.389±0.145*# 1.089±0.174*# 0.740±0.080*# 1.011±0.196**#SMAO+MLR 1.661±0.100**##△ 1.329±0.079**##△ 0.871±0.120**##△ 1.348±0.180**##△△

Tab.4 Effect of MLR on TNF-αcontents of homogenate in SMAO shock rats(ng/g,±s,n=6)

MLR:Mesenteric lymph reperfusion;SMAO:Superior mesenteric artery occlusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MLR group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs SMAO group

Group Liver Lung Kidney Myocardium Sham 27.90±5.47 36.33±6.54 21.05±3.41 26.58±7.32 MLR 28.05±4.56 38.85±7.90 22.41±4.77 28.87±5.69 SMAO 35.50±5.76*# 48.98±2.50*# 26.68±4.80*# 136.31±7.14**##SMAO+MLR 41.34±8.80**##△△ 56.28±9.27**##△△ 29.98±6.91**##△ 42.84±7.03**##△△

3 讨论

炎症介质大量释放引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是多种致病因素导致多器官损伤甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的关键环节;内毒素移位至远隔器官刺激单核巨噬细胞系统产生并释放大量的炎症介质是机体炎症反应失控的主要因素之一[8]。为此,本文从内毒素经肠淋巴途径移位的角度,探讨MLR加重SMAO休克大鼠多个器官损伤的作用机制。

研究发现,SMAO休克组大鼠血浆以及肝、肺、心、肾等组织中ET的水平显著增高,提示SMAO休克后器官损伤的机制与内毒素移位有关,其主要机制为缺血1 h引起肠粘膜缺血性损伤、再灌注2 h引起肠粘膜的再灌注损伤导致了肠屏障功能障碍,继而引起了肠源性内毒素移位,导致血浆以及远隔器官中ET水平提高。而行MLD与SMA同时夹闭1 h恢复再灌2 h的SMAO+MLR组大鼠血浆与肝、肺、心、肾组织匀浆的ET水平高于SMAO组,说明MLR加重了SMAO休克大鼠内毒素移位的程度,其作用机制与ET经肠淋巴途径移位增多有关。实验结果从ET角度证实了MLR加重SMAO休克的作用机制与肠源性内毒素移位有关,其机制可能与SMAO状态下MLR引起了肠系膜微淋巴管损伤、肠源性内毒素通过肠系膜微淋巴管吸收和转运增多有关。

研究表明,LPS不仅直接损伤内皮细胞,而且还与LBP相结合形成LPS-LBP复合物,在LBP运载下与单核巨噬细胞表面的CD14结合,激活免疫细胞,产生炎症介质及细胞因子,促进组织损伤,可见,LBP和CD14这一组蛋白与内毒素引起炎症介质释放的作用机制关系密切[9]。同时,LBP的存在使LPS刺激合成炎症介质TNF-α的阈值下降,并使LPS诱导激活巨噬细胞生成细胞因子的速度较LPS单独作用时迅速增加,而抗LBP抗体可明显抑制LPS刺激细胞产生TNF-α的能力;CD14可增强CD14+细胞对LPS的反应性;CD14-细胞在转染CD14后对LPS的反应性可增强1000倍;可见 LBP/CD14不仅是LPS引起损伤的信号转导途径中的关键分子,而且具有显著的LPS增敏效应,LBP/CD14系统也被称作内毒素增敏系统[10]。本文通过检测 LBP、CD14、TNF-α的研究发现,SMAO休克组大鼠肝、肺、心、肾等组织LBP、CD14的含量均显著升高,成为LPS引发炎症反应的重要环节,增高的TNF-α则是内毒素移位、LBP/CD14增加LPS作用的结果;SMAO+MLR组大鼠肝、肺、心、肾组织匀浆 LBP、CD14的含量显著高于SMAO组,提示MLR增加了SMAO休克大鼠内毒素致敏系统的活性,这也是最终引起炎症介质TNF-α释放增多、加重组织器官炎症反应与损伤的重要机制。

综上,MLR增加了SMAO休克大鼠肠源性ET经肠淋巴途径移位至远隔器官,同时激活LBP/CD14系统,提高器官组织对肠源性ET的敏感性,诱导产生并释放TNF-α等炎症介质,加重炎症级联反应与器官损伤,肠源性内毒素移位在MLR加剧SMAO休克多器官功能障碍的发病学中具有重要的作用。研究结果也提示,通过对LPS-LBP/CD14系统及肠淋巴途径的干预,可减轻SMAO休克的炎症级联反应,这对于防治器官损伤具有一定的参考价值及指导意义。

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