丁苯酞对酒精依赖大鼠海马谷氨酸含量及NR2B表达的影响*

杜爱林,李 爽,姜洪波,李文强,郝 伟,张瑞岭△

(1.新乡医学院生理学教研室,2.河南省生物精神病学重点实验室,3.二附院,4.三附院,新乡 453003)

酒精依赖或称为酒瘾,是一种非要饮酒不可的强迫心理状态,可以连续或周期性出现。丁苯酞(butylphthalide,NBP)是我国成功研制出的具有自主知识产权的一类化学新药,主要用于治疗缺血性脑卒中。研究表明,NBP可抑制谷氨酸释放,抑制Ca2+内流[1]。本实验通过观察NBP作用于酒精依赖大鼠后,戒断症状评分、海马谷氨酸(Glu)含量及N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate acceptor)2B亚基(NR2B)mRNA表达变化,探讨NBP对酒精依赖大鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制备

郑州大学动物中心提供清洁级成年健康SD雄性大鼠50只(许可证号:scxk(豫)2005-0001),体重200～220 g,随机分为五组(n=10),分别为A:正常组,B:酒精依赖模型组,C:NBP低剂量组,D:NBP中剂量组,E:NBP高剂量组,各组平均体重差别无统计学意义。除正常组外,各组饮含6%(v/v)酒精水溶液28 d[2]。14 d后,NBP用植物油稀释后每日灌胃一次,剂量为低剂量组NBP 10 mg/kg,中剂量组NBP 20mg/kg,高剂量组NBP 40 mg/kg,正常组和酒精依赖模型组等剂量植物油灌胃5 ml/kg。

1.2 药品及试剂

丁苯酞由石药集团恩必普药业有限公司提供。Trizol试剂、SYBR·Premix Ex TaqTM II试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司、引物由上海生工生物工程有限公司合成。谷氨酸标准液购自上海康达氨基酸厂。

1.3 戒断评分

各组动物按Erden等[3]戒断评分表于末次饮酒后6 h观察戒断症状18 min。主要观察指标为大鼠戒断行为体征(刻板行为、激惹性、尾巴强直、异常姿势)和听源性癫痫发作情况。

1.4 高效液相色谱分析谷氨酸水平[4]

大鼠麻醉断头,剥离海马称重,加入1 ml甲醇-水离心液,低温匀浆,取部分匀浆液4℃,10 000×g,离心15 min,取上清,滤膜过滤后-80℃保存待测。组织中含量以μ g/g计。样品经OPA(O-phthalaldehyde)衍生后,用高效液相色谱仪(美国VARIAN Prostar)分析。流速1.0ml/min、激发波长250 nm,发射波长410 nm,以GLU峰面积定量。

1.5 实时荧光定量PCR反应

1.5.1 cDNA制备 快速断头处死各组试验动物,冰盘上操作取海马区脑组织50～100 mg,立即放入Trizol试剂中进行RNA抽提。以260 nm及280 nm吸光度值计算所获RNA含量及纯度,分装后-70℃保存。逆转录过程按试剂盒说明书操作。

1.5.2 PCR引物设计 根据标准荧光定量PCR引物设计原则,通过Primer 5.0程序设计,NR2B引物序列为:上游引物:5′-CTT ACT GAA GGC AAT CCT CG-3′,下游引物:5′-TCC TCA GAA CAC CTT CGC TT-3′;ACTIN 引 物序 列 为上 游引物:5′-ATGGATGACGATATCGCTGCG-3′,下 游 :5′-TCGTCCCAGTTGGTGACAATG-3′,由上海生工生物工程公司合成。

1.5.3 PCR 过程 SYBR·Premix Ex TaqTM(2 ×)12.5 μ l、NR2B/ACTIN F(10 pmol/L)1 μ l、NR2B/ACTIN R(10 pmol/L)1 μ l、模板 cDNA 2μ l、ddH2O 8.5μ l(总体积 25μ l)于 PCR 反应管中。在FTC-2000型荧光定量PCR仪(加拿大枫岭生物技术(上海)有限公司)上行PCR,扩增条件如下:(1)95℃3 min预变性;(2)95℃20 s变性,60℃30 s退火延伸,40个循环。

1.5.4 荧光实时定量PCR分析 分别测定每个样品NR2B和ACTIN mR NA的Ct值,每个样品均作复孔以减少操作误差。采用相对定量方式表示各样品NR2B的△Ct,△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。再依据△△Ct=△Ct目的基因△Ct参照因子,计算 2-△△Ct。对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时监测,根据扩增曲线确定Ct值(cycle threshold),利用2-△△Ct法计算NR2BmRNA相对拷贝数。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 丁苯酞对酒精成瘾大鼠戒断评分的影响

戒断评分结果显示,酒精成瘾可使大鼠戒断评分明显增加,中高剂量丁苯酞均可使大鼠戒断评分下降(表1)。

Tab.1 Effect of NBP on the ratswith alcohol addiction(±s,n=10)

Tab.1 Effect of NBP on the ratswith alcohol addiction(±s,n=10)

*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group;△P＜0.05 vs low-dose group

Group Score withdrawal syndrome Glutamate(μ mol/g) NR2B Control 10.38±1.40 3.21±0.60 1.03±0.14 Model 13.22±2.27**0.35±0.06**3.78±0.49*Low-dose 13.51±2.63 0.31±0.07 3.21±0.65 Medium-dose 11.37±1.19#△0.29±0.07 1.37±0.89#△High-dose 11.28±1.08#△0.28±0.06 1.74±1.19#△

2.2 丁苯酞对酒精成瘾大鼠海马区谷氨酸含量的影响

高效液相色谱分析结果显示,酒精成瘾可使大鼠海马区谷氨酸含量明显减少,各剂量丁苯酞对酒精成瘾所引起的大鼠海马区谷氨酸含量减少没有明显影响(表1、图1)。

2.3 丁苯酞对酒精成瘾大鼠海马区NR2B mRNA含量影响

荧光实时定量PCR结果显示,酒精成瘾可使大鼠海马区NR2B mRNA表达明显上升,中、高剂量丁苯酞使大鼠海马区NR2B mRNA表达减少(表1、图2)。

3 讨论

丁苯酞(butylphthalide,NBP)具有较强的抗脑缺血作用,能改善脑能量代谢和缺血脑区的微循环,抑制神经细胞凋亡,并具有抗脑血栓形成和抗血小板聚集作用。NBP可能通过降低花生四烯酸含量,提高脑血管内皮NO和PGI2的水平,抑制谷氨酸释放,降低细胞内钙浓度等机制而产生上述药效作用。

Fig.1 HPLC chromatograms of Glu in the hippocampus of rats

本研究采用给大鼠自由饮含6%酒精(v/v)的水溶液28 d的方法,建立酒精依赖大鼠模型[2]。本研究酒精依赖模型组大鼠在酒精撤除6 h后,综合评分明显比正常组高,有显著性差异,表明酒精依赖大鼠模型制作成功。给予丁苯酞(butylphthalide,NBP)中、高剂量干预后,综合评分降低,与实验对照组相比有显著性差异,表明NBP能够减轻酒精戒断症状。为了探讨NBP的神经保护作用机制,我们分别检测了大鼠海马区谷氨酸(Glu)含量和NMDA受体亚基NR2B蛋白表达。

Fig.2 Amplification curve of NR2B mRNA in the hippocampus of rats

在哺乳动物脑内,海马(hippocampus)与酒精成瘾密切相关。而脑组织中谷氨酸(Glu)受体N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)在海马组织有丰富表达。研究表明,酒精能够通过作用于NR2B受体,造成神经细胞损伤和成瘾。本实验结果表明,酒精成瘾大鼠海马区Glu含量较正常组显著降低(P＜0.01),而NR2B mRNA表达明显升高。这与既往研究结果一致。加入NBP后,酒精成瘾大鼠海马区NR2B mRNA表达明显下降,但是海马区Glu含量无显著性差异(P＞0.05)。说明NBP可以下调酒精成瘾引起的海马区NR2B mRNA表达,但是其作用途径与Glu无关。

NR2B表达上调可导致过量饮酒及复发。NMDA受体被激活后,触发Ca2+等阳离子的内流,使神经元逐步坏死。NBP能够减轻细胞内钙超载,NBP中、高剂量组与实验对照组比较,海马组织NR2BmRNA表达明显降低,差异具有显著性,提示NBP可能通过使NR2B mRNA表达下调,使NMDAR数量减少,进而抑制Ca2+内流,减轻细胞内 Ca2+超载,使大鼠戒断症状减轻。

本研究为NBP的神经保护作用提出了新的可能机制,对于指导酒精成瘾的临床治疗也具有一定的理论意义。

[1]秦荣新,梁健成.丁基苯酞的药理及临床研究进展[J].海峡药学,2009,21(1):100-101.

[2]李 菁,袁孝如,李跃华,等.酒精依赖大鼠模型建立[J].中国药物依赖性杂志,2006,15(6):433-436.

[3]Gray S,Borgundvaag B,Sirvastava A,et al.Feasibility and reliability of the SHOT:A short scale for measuring pretreatment severity of alcohol withdrawal in the emergency department[J].Acad Emerg Med,2010,17(10):1048-1054.

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