顺式CA1P对肿瘤细胞增殖和血管生成的影响*

夏元铮,杨 勇,王 卓,段静静,李娴静,赵安鹏,孙秀兰

(1.南京医科大学基础医学院药理学系,江苏南京 210029;2.中国药科大学转化医学实验室,江苏 南京 210009)

小分子微管蛋白破坏剂考布他汀(combretastatins)家族,是从非洲矮柳树(combretum caffrum tree)中发现并分离得到的一大类化合物[1,2],考布他汀A-1(combretastatin-A1,CA1)是combretastatins家族中的一员,通过结构修饰加入磷酸基团[3]解决了其水溶性低的问题。考布他汀A-1磷酸盐(combretastatin-A1 di-phosphate,CA1P)有顺、反两种异构体[1],顺式CA1P目前正处于临床研究阶段,作为双重机制的血管阻断剂(vascular disrupting agent,VDA)用于实体瘤的治疗。反式CA1P对实体瘤没有治疗效果,但能显著增强CA4P(第一代考布他汀家族成员,CA1P是它的第二代结构类似物)的抗实体瘤效果[1]。顺式CA1P既可与其他化疗药物联合使用,也可作为抗肿瘤药物单独使用[4,5]。本文工作应用多种肿瘤细胞株、制备鸡胚尿囊膜模型、离体培养大鼠动脉血管环,研究顺式CA1P对肿瘤细胞增殖和血管生成的作用。

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞株,鸡胚胎和实验动物

人胃癌细胞株MGC-803、人急性髓系白血病细胞株U937、人黑色素瘤细胞株A375、人结肠癌细胞株HCT116、人三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人乳腺癌细胞株MCF7和SK-BR3、人白血病细胞株K562和KA、人肺癌细胞株A549和H460、人肝癌细胞株HepG2、人正常肝细胞株L02,由中国药科大学转化医学实验室提供。

受精鸡胚胎,德国伊沙鸡种,购于河北良人牧业有限公司。

Wistar大鼠,雄性,体重106～200 g,购于上海斯莱克实验动物有限公司,生产许可证号:SCXK(沪)2007-0005,使用许可证号:SYXK(苏)2007-0025。

1.2 药品与试剂

注射用顺式考布他汀二磷酸四钠(cis-combretastatin A-1 phosphate,cis-CA1P)冻干粉针(10 mg/bottle,南京臣功制药有限公司合成);紫杉醇(Taxol,上海骏杰生物技术有限公司产品)。

96孔板(Costar公司);24孔板(Costar公司);RPMI1640培养基(Gibco公司);DMEM培养基(Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青公司);胎牛血清(Gibco公司);噻唑蓝(MTT,AMRESCO公司);DMSO(AMRESCO公司);纤维蛋白胶(上海松力生物技术有限公司);M199培养液(Invitrogen公司)。

CA1P临用前用相应的培养基现配并避光放置[1,5]。

1.3 仪器

超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);二氧化碳培养箱(RS Biotech公司);全自动酶联免疫检测仪(瑞士TECAN公司);捷达形态学图像分析系统(国产,批号:20006171);鸡胚孵化箱(德州旭升);高压蒸汽灭菌锅(上海人和科学仪器有限公司)。

1.4 MTT法测定肿瘤细胞存活情况

将待测肿瘤细胞消化、计数、接种于96孔板中,细胞密度:0.5～2×104cells/ml,在 37℃,5%CO2培养箱培养24 h;将药物用培养基稀释到不同浓度,100 μ l/well,并设立空白对照组,置 37℃,5%CO2培养箱培养48 h后加入MTT(20 μ l/well),在培养箱继续孵育4 h,吸净孔内的液体,每孔再加入100 μ l DMSO,摇床10 min轻轻混匀,于酶标仪上进行检测,检测波长570 nm,参照波长630 nm。检测出每孔的OD值,计算IC50。

1.5 鸡胚尿囊膜模型的建立

受精鸡胚置于孵化箱中孵化9 d(气室端向上)。然后将鸡胚用酒精擦拭后静置15 min,在鸡胚的上方划一个2×2 cm2大小的开窗位置,用剪刀磨切开窗,吹去蛋壳上磨切的粉尘,揭去开窗处的蛋壳,再用虹膜剪刀剪破壳膜,暴露出绒毛尿囊膜。将15 μ l CA1P加在经高压灭过菌的0.5×0.5 cm2大小的Whatman滤纸上,依次每个鸡胚尿囊膜的给药量分别为:1.5 ng、15 ng和150 ng;然后将滤纸放在绒毛尿囊膜两条大血管间的无血管部位,用灭菌透明胶带封窗。再将鸡胚放入孵化箱中孵化两天后,揭去封窗的透明胶带,用数码相机拍照,解剖显微镜(10倍)下计数载体边缘血管数目,根据血管外径将血管分为3类:大血管:血管外径0.1 mm以上;中血管:0.1～0.05 mm;小血管:血管外径0.05 mm以下凡属于趋向性生长的血管,即以载体为中心发出,与滤膜半径夹角小于45°者均予计数,而穿行绕行的血管则不计算在内,两人分别各自读取数据,数据取平均值并与对照组比较。

1.6 离体培养大鼠动脉环

体重106～200 g的雄性Wistar大鼠一只,脱臼法处死,取胸主动脉,去除外围结缔组织和脂肪组织,剪成长约1 mm的动脉环,用M199无血清培养液漂洗。将大鼠主动脉段包埋于24孔板中的纤维蛋白胶中,用M199培养液进行体外培养,顺式CA1P直接加到培养液中,终浓度分别为:0.008 μ g/ml、0.04 μ g/ml和 0.2 μ g/ml,并设立对照组 ,对照组直接用M199培养液培养;每2天换液1次。7天后于倒置显微镜下观察动脉环附近内皮细胞和新生血管的生成情况,拍照并与对照组比较。

1.7 数据分析

应用GraphPad Prism 5.0统计学软件计算药物对各细胞株的IC50。数据以均值±标准差(±s)表示,使用GraphPad Prism 5.0统计学软件对数据进行处理,在方差齐性的前提下,每组数据分别与空白对照组进行双尾student'st检验。

2 结果

2.1 顺式CA1P对各肿瘤细胞株的作用

研究结果表明:CA1P抑制人胃癌细胞株MGC-803、人急性髓系白血病细胞株U937、人黑色素瘤细胞株A375、人结肠癌细胞株HCT116、人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人白血病细胞株K562的生长,且对细胞的生长抑制呈明显量效关系(表1)。对人白血病细胞株KA-1/A3、人肺癌细胞株A549和H460、人乳腺癌细胞株MCF7和SK-BR3、人肝癌细胞株HepG2、人正常肝细胞株L02未见显著的抑制作用。

Tab.1 Inhibitory effects of cis-CA1P on tumor cells invitro(mol/L)

2.2 顺式CA1P抑制鸡胚尿囊膜血管的生成

分别给予 CA1P 0.1 ng/μ l、1 ng/μ l和 10 ng/μ l处理后,与对照组鸡胚尿囊膜的血管生成比较,1 ng/μ l和10 ng/μ l浓度的CA1P使血管生成受到显著抑制,大血管形成显著减少(图1)。结果表明,CA1P能抑制鸡胚尿囊膜血管的生成。

Fig.1 Cis-CA1P shows a significant dose-effect relationship in inhibiting the vesselformations of chicken embryo chorioallantoic membrane(±s,n=10)

2.3 顺式CA1P对离体培养的大鼠动脉环血管生成的作用

通过倒置显微镜观察内皮细胞从动脉段切口处向外生长,形成具有分枝的微血管样结构。与未用CA1P处理的对照组动脉段比较 ,0.008 μ g/ml、0.04 μ g/ml、0.2 μ g/ml CA1P 处理后 ,动脉环的毛 细血管样结构生成显著减少(图2)并呈剂量依赖性。说明CA1P具有抑制大鼠动脉环血管生成的作用。

Fig.2 Cis-CA1P shows a marked dose-dependent decrease in anti-angiogenesis of excised thoracic aorta annulations in rats

3 讨论

以往研究表明,顺式CA1P的抗肿瘤机制包括:与微管蛋白结合抑制微管的聚合,阻断和破坏肿瘤血管的生长,造成大量肿瘤细胞死亡和坏死[1-3];在体内被过氧化物酶、酪氨酸酶以及Fe3+氧化,形成邻醌中间物Q1和Q2[2-6],激活氧化应激通路,产生直接的细胞毒性作用,该机制可以介导顺式CA1P对肿瘤细胞产生直接的细胞毒性作用,增强杀伤肿瘤细胞的效果[3,5,6]。

CA1P的顺、反异构体,经过体内代谢都可以产生醌类中间物,但只有顺式异构体能与微管蛋白结合。本实验首次利用多种人肿瘤细胞株研究顺式CA1P对细胞增殖的影响,结果显示顺式CA1P对多种人肿瘤细胞株均有较好的抑制作用,特别是对胃癌细胞MGC-803的抑制有很好的效果。本文利用人正常肝细胞株L02进行研究,未见CA1P对细胞增殖的抑制作用,提示CA1P对人肿瘤细胞的抑制作用可能具有一定的选择性。

CA1P是血管阻断剂,可破坏已经存在的血管。为了初步探索CA1P对血管新生的影响,本文在制备鸡胚尿囊膜模型和离体培养大鼠动脉环的基础上,研究了CA1P对新生血管生成的作用。研究结果显示,CA1P对鸡胚尿囊膜血管生成具有显著抑制效应、使大血管减少;CA1P可抑制离体培养大鼠动脉环毛细血管样微血管结构的形成。表明CA1P不仅可破坏已生成的血管,而且可对抗肿瘤血管的发生发展。

另外,作者在研究中发现,顺式CA1P的LD50值远远高于治疗剂量;其与奥沙利铂联合应用时对肿瘤细胞和肿瘤移植瘤的抑制效果优于两药单独使用的效果,同时也降低了奥沙利铂的使用剂量(数据未显示)。综上所述,作为第二代考布他汀的代表药物,顺式CA1P可能是一个具有很好应用前景的抗肿瘤药物。

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