超滤质谱法筛选与人血清白蛋白作用的大豆异黄酮粉中异黄酮成分

杨 睿，喻 花，王 献

(中南民族大学化学与材料科学学院，湖北 武汉 430074)

1 引言

蛋白质通常是药物在体内发挥药理作用的主要靶点，在药物作用机理的过程中，大多数药物都是通过与生物大分子靶点相互作用来发挥药效的。因此，深入研究蛋白质与药物小分子之间的相互作用的过程和机理，不仅有助于从分子水平上理解药物的作用机制，也可为筛选以特定蛋白为靶点的药物先导体以及新药的开发与设计开辟新的途径。

目前对药物分子与生物靶分子的作用的研究主要有以下方法:紫外－可见分光光度法、荧光光谱法、圆二色谱法、色谱质谱联用法、核磁共振法、电化学方法等［1～5］。近年来，超滤质谱技术的发展为研究药物分子与生物靶分子的作用提供了新的方法。超滤质谱技术是一种将超滤技术与质谱分析方法联合使用所形成的一种新的研究手段，主要是利用亲和原理，将生物靶分子与潜在药物分子混合得到受体－配体复合物和未结合的药物分子，通过超滤来将未结合的药物分子去除，然后用有机溶剂或者改变溶液pH值将复合物中的药物分子释放出来，用LC－MS检测释放出来的活性药物分子进行分析鉴定。该方法将超滤技术的分离特性与质谱技术的高速，高灵敏性，高准确度等特点结合起来，可以很方便的识别与生物靶分子相结合的药物配体，从而实现先导化合物的快速筛选［6，7］。

大豆异黄酮的基本骨架为3－苯基苯并二氢呋喃，主要有黄豆苷元、染料木素、染料木苷、大豆苷［8］。天然存在的大豆异黄酮较多，共有12种，它们大多以β葡萄糖苷形式存在，其中起生理药理作用的主要是染料木素和大豆黄素。大豆异黄酮因具有明显的生物学活性，如抗肿瘤作用、对血管的防护作用、抗氧化活性、抗炎、改善骨质疏松、类似女性雌激素作用以及抗激素作用等［9］，有关大豆异黄酮类药物和保健品的开发和应用已经被广泛关注。

本工作采用超滤质谱的方法，对人血清白蛋白与4种主要的大豆异黄酮及大豆异黄酮粉样品的结合做了研究，证明了大豆异黄酮粉中的主要成分为大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素，并且以此为模型确立了一套用超滤质谱法筛选快速筛选蛋白质配体的方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪(美国 Agilent公司);Agilent 6520 Q－TOF四级杆飞行时间质谱仪(美国Agilent公司);GL－20M高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);YM－10超滤膜购自Millipore公司;大豆异黄酮片购自吉林修正药业保健品有限公司;人血清白蛋白HSA购于Sigma公司;大豆苷、大豆苷原、染料木素、染料木苷标准品纯度均≥95%，购自Sigma公司;甲醇、乙腈均为色谱纯(德国MERCK公司);水为超纯水(Molelement 1815a摩尔元素型超纯水机，上海摩勒科学仪器有限公司);其他试剂均为优级纯。

2.2 样品制备

样品制备方法参考已知文献［13，14］，大豆异黄酮片粉碎60℃真空干燥至恒重，过100目筛板，密封备用。准确称取5.0 g大豆异黄酮片粉末，按照料液比1∶5加入70%甲醇，浸泡120 min后超声提取60min，提取液4000 r/min离心15min后取上清备用。大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素标准品用甲醇配成4 mol·L－1的储备液。人血清白蛋白用10 mM的CH3COONH4溶液(pH 值=6.86)配成40μM备用。

2.3 仪器条件

2.3.1 色谱条件

色谱柱为 C18分析柱(150 mm×4.6 mm×5μm)，柱温 25 ℃，流速 0.4 mL·min－1。液相条件:流动相A为纯水，B为乙腈，梯度洗脱。t=0 min，80%A(20%B);t=0 ～5 min，70%A(30%B);t=5～15 min，40%A(60%B);t=15 ～20 min，5%A(95%B)。进样体积为5μL。

2.3.2 质谱条件

电喷雾电离离子源(ESI);负离子模式检测;扫描范围m/z 100～1000;毛细管温度350℃;喷雾电压4.0 kV;干燥气流速 10 L·min－1;碎裂电压 175V。

2.4 超滤实验

参照文献方法［10～12］，吸取 10μL 大豆异黄酮粉提取物溶液和人血清白蛋白溶液10μL加至10 mM的醋酸铵缓冲溶液中，室温反应30 min，置于YM－10型超滤管中于离心力10000r/min下超速离心15 min，滤膜加10 mM醋酸铵缓冲液离心清洗3次，将未结合配体分子洗去。再向滤膜中加入甲醇/水(50∶50;V/V)，静置30 min后于10000 r/min下离心15 min，重复3次，收集洗脱液用于LC－MS分析。为排除超滤膜自身对于小分子的吸附作用引起的实验误差，在每次实验同时加入一组不加蛋白质的空白实验作为对照。

3 结果与讨论

3.1 标准品混合溶液的液质联用(LC－MS)分析

将大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素4种物质的标准品配置成总浓度为40 μM的混合溶液，其中各组分的最终浓度均为10 μM。优化LC分离条件和ESI－MS的仪器条件对标准品混合溶液进行分离和ESIMS检测，结果见图1。

图1 4种大豆异黄酮标准物质混样超滤质谱提取离子流图(EIC)

由图1可以看到混合溶液在C－18柱中分离出了4个色谱峰，4个组达到了基线分离并且峰型比较对称无明显拖尾现象。用Q－TOF质谱数据分析软件将4种大豆异黄酮物质在负离子模式下可能形成的离子进行分析计算，见表1。

表1 4种大豆异黄酮物质在负离子模式下可能出现的带电离子类型及精确分子量

图2中，(a)(b)(c)(d)分别为保留时间1.713min、3.805min、6.848min 和 9.953min 的质谱图。对比表1可知，图2(a)中保留时间为1.713min的物质是大豆苷，质谱图中的主要离子为 m/z 253.05023、415.10324、451.08016、461.10906 和 475.12502，分别为大豆苷元的(M－H)－，(大豆苷具有一定的不稳定性，在本实验条件下有可能在离子源中或质谱中分解为大豆苷元)，大豆苷的(M－H)－，大豆苷的(M+Cl)－，大豆苷的(M+HCOO)－及大豆苷的(M+CH3COO)－峰。(b)中保留时间为3.805 min的物质是染料木苷，质谱图中m/z 431.09998的离子为染料木苷的(MH)－峰。(c)中保留时间为6.848min的物质是大豆苷元，m/z 253.05174离子为大豆苷元的(M －H)－峰。(d)中m/z为269.04654为染料木苷的(M －H)－峰，确定9.953min的物质为染料木素。

图2 4种大豆异黄酮标准物混合溶液中各组分的质谱图

图3 pH值6.86时大豆异黄酮粉样品与HSA的超滤质谱EIC图

3.2 超滤质谱法筛选大豆异黄酮粉中与人血清白蛋白结合的黄酮类成分

大豆异黄酮粉实际样品与HSA孵育后，进行超滤实验，所得溶液进行LC－MS分析，HPLC分离条件和质谱条件与上述标准品一致。对所得到的总离子流图提取4种大豆异黄酮所可能的电荷分子做EIC提取离子流图，结果如图3所示。与空白对照组(即未加蛋白质组)相比，加入HSA蛋白质的样品组中4组EIC峰都存在不同程度的增加。因为在相同实验条件下，色谱峰的积分面积与溶液中物质的浓度成正比，通过对比两组不同实验色谱峰的积分面积可以知道4种大豆异黄酮与HSA都有着不同程度的结合。图4中(a)(b)(c)(d)分别为4组峰的MS谱图。与4种大豆异黄酮标准物的EIC和MS进行比较，通过4组峰的保留时间和每组峰质谱的特征离子，可以确认4个峰所代表的物质按照保留时间先后顺序分别为大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素。

图4 大豆异黄酮粉样品中四种物质的ESI－MS谱图

4 结语

本实验采用超滤质谱法研究大豆异黄酮粉及人血清白蛋白，通过对照标准品的质谱图以及提取离子流图确定复杂样品中与蛋白质靶点结合的有效物质，建立起了一套行之有效的快速筛选天然产物中有效成分的方法。此方法也可以扩展应用于其他天然药物提取物中活性成分的快速确认和鉴定。

在实验过程中，应该注意以下几个关键问题:超滤膜的选择，目前市面上可供选择的超滤膜有很多种，需要根据对象蛋白质的分子量来选取合适型号的超滤膜，同时还要考虑超滤膜的死体积大小;孵育过程中需要控制蛋白质与配体的相对摩尔比，以达到较好的吸附效果;超滤试验中解离液的选择，常用的解离液包括有机溶剂解离液和酸性或者碱性解离液。在本实验中，由于黄酮苷样品在酸性条件下会发生水解反应，所以选用的有机溶剂作为解离液。

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