新型黑素细胞涂布法移植卡波姆胶载体制备研究

鲁严，周梅华，李雪，吴迪，王大光，朱文元

（南京医科大学第一附属医院,南京 210029）

自体黑素细胞移植是一种常用的治疗稳定期白癜风的外科疗法，该疗法原理是将自身正常表皮的黑素细胞通过体外培养扩增后移植到白癜风皮损处，使此处黑素细胞得以补充、成活，从而在皮损处产生色素。以往该法因细胞悬液滴种时常因受植部位、体位的变化，常常不能均匀分布，复色效果会受到影响，我们拟研制一种以卡波姆（carbomer）胶为基质的载体，克服以上缺点，可以用于黑素细胞涂布法移植，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 卡波姆940购自美国Noveon公司，Ham F12培养基、DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、胰蛋白酶、分散酶（dispase enzyme）购于美国 Gibco 公司，geneticin（G418）、左旋多巴（Laevodopa,L-DOPA）、12-0-十四酰佛波醇-13-乙酸酯（12-0-Tetradecanoylphorbol 13-acetate,TPA）、 噻 唑 蓝 [3-（4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,MTT]均购于美国Sigma公司。实验家兔由南京医科大学动物实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 黑素细胞培养 标本来自我院泌尿外科健康男性包皮环切术后丢弃表皮组织。按照Swope等的方法[1]，去除包皮的皮下组织，并剪成小皮片，经Dispase酶4℃消化分离表真皮，表皮经0.25%胰蛋白酶消化后获得单细胞悬液，接种于含常规黑素细胞培养基的培养瓶中，置于5%CO2培养箱37℃孵育。6 h后换液1次去除未贴壁细胞，48 h后改用不含geneticin的培养基，3天后换液，加入含40 μg/L TPA的黑素细胞培养基进行纯化培养。当细胞长满70%～80%时，用2.5 g/L胰酶消化传代。黑素细胞鉴定采用 HMB45（human melanoma black-45）和马森卡塔纳氏（Masson-Fontana）染色。

1.2.2 卡波姆胶半固体培养基的配置 称取卡波姆9 405 g，与500 mL含TPA的培养基混合均匀，即得质量分数为1%卡波姆940黑素细胞载体胶液，注意配制时将卡波姆940干细粉分次撒于培养基液面上，使其充分溶胀，避免结块。测定PH，10 mol/L NaOH调PH至6.5呈凝胶状。

1.2.3 卡波姆胶对黑素细胞毒性和增殖的影响 （1）对黑素细胞成活率的影响：取对数生长期的黑素细胞，以浓度5×105/mL 1mL接种于6孔板内，加入1%卡波姆940黑素细胞载体胶液进行培养，同时设空白对照。5%CO237℃分别培养 1 h，3 h，6 h，12 h，24 h及36 h后2 500转/min离心15 min收集细胞，TPA黑素细胞培养液洗涤2次，常规台盼蓝染色测定细胞成活率。（2）对黑素细胞增殖的影响：取对数生长期的黑素细胞，以浓度5×105/mL 200 μL接种于96孔板内，加入1%卡波姆940黑素细胞载体胶液进行培养，同时分别设常规黑素细胞培养基对照。分别培养 1 h，3 h，6 h，12 h，24 h 及 36 h 后2 500转/min离心15 min，吸弃卡波姆胶后换为常规黑素细胞培养基，每孔再加入MTT液（5 g/L）20 μL，充分混匀继续培养4小时后弃上清液，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）150 μL，振荡10 min左右；置酶标仪于490 nm波长测吸光度值（A），细胞增殖率用药物处理组A值/空白对照组A值的百分数表示。

1.2.4 卡波姆胶对黑素细胞迁移的影响 Transwell培养板的小室由带8.0 μm孔径微孔的聚碳酸酯膜分成上下2室，该膜必须于试验前1天用含有5 μg纤维连接蛋白的黑素细胞培养液500 μL包被，室温过夜晾干。将1%卡波姆940黑素细胞载体胶液与黑素细胞（5×105/mL）混合凝胶加于上室（聚碳酸酯膜上），并设空白对照，分别培养6 h，12 h，24 h取出聚碳酸酯膜并用甲醇固定，HE染色，膜上层（未迁移到下层）的黑素细胞及凝胶用棉拭子轻轻擦去，高倍镜下随机取4个高倍视野计数通过8.0 μm孔径微孔膜迁移到膜下层的黑素细胞。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件对实验结果进行t检验，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 卡波姆胶对黑素细胞毒性和增殖的影响 在1%卡波姆胶作用黑素细胞 1，3，6，12，24 及 36 h后，黑素细胞的成活率和增殖率分别与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图1、表1。

表1 卡波姆胶对黑素细胞成活率和增殖率的影响 (n=4,±s）

表1 卡波姆胶对黑素细胞成活率和增殖率的影响 (n=4,±s）

注：与对照组比较，a：P<0.05，b：P＜0.01。

组别对照组1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 36 h细胞成活率（%）100 98.79±1.10 97.84±1.66 97.65±1.91 97.03±3.17 96.75±2.62 94.39±4.61细胞增殖率（%）100 96.35±2.40 95.68±2.91 94.24±3.71 93.90±3.94 93.66±4.33 92.79±4.84

2.2卡波姆胶对黑素细胞迁移的影响 1%卡波姆胶作用6 h时分别与对照组和其他时间组比较，黑素细胞的迁移受到抑制，差异具有统计学意义（P<0.05）；1%卡波姆胶作用12 h、24 h分别与对照组比较，黑素细胞的迁移率无明显差别（P>0.05）；1%卡波姆胶作用24 h黑素细胞的迁移率略强于12 h（P<0.05），结果见图2、表2。

表2 1%卡波姆胶作用不同时间对黑素细胞迁移的影响 (n＝5,±s)

表2 1%卡波姆胶作用不同时间对黑素细胞迁移的影响 (n＝5,±s)

时间6 h 1 2 h 2 4 h对照组3 1.3±2.5 5 0.0±7.5 8 6.0±8.9 1%卡波姆胶组1 2.7±4.5 a 4 3.0±4.0 7 4.3±5.7

3 讨论

卡波姆 (carbomer)又名聚羧乙烯(carboxy polymethleme,CP)，是一种由丙烯酸与烯丙基蔗糖交联而成的高分子聚合物，其化学名为Carboxypolymethylene，卡波姆胶是一种多用途的高分子材料和药用辅料，在国内外被广泛应用于药品和化妆品的研制生产，最早由美国Goodrich公司生产，现已收入美、英等国药典,我国2000年版药典就已收载[2]。卡波姆胶作为黑素细胞涂布法移植的载体国内外未有报告。

我们的预实验表明：采用黑素细胞培养基配置的1%卡波姆胶对黑素细胞共培养1 h，3 h，6 h，12 h，24 h及36 h后，分别用台盼兰测定黑素细胞存活率及MTT测定细胞增殖能力，结果显示不同时间点测定组与对照组比较差异无统计学意义，另Transwell培养板测定发现1%卡波姆胶在12 h后对黑素细胞迁移无影响。以上结果显示采用卡波姆胶混合黑素细胞，不影响体外培养的黑素细胞生物学功能，可以作为新型涂布法移植的细胞载体。

早在1998年有人将组织工程学应用于白癜风细胞移植。Olsson[3]等将制备好的表皮基底细胞悬液均匀的移植到色素脱失部位，外用胶原薄膜封包，胶原膜对黑素细胞的定植生长有益处。以后又有人使用组织工程材料比如羧酸、壳聚糖凝结成膜包被的培养基，可以明显改善细胞的生成条件，并减小收获细胞时对细胞造成的损伤[4-5]。Van GeelN[6]将透明质酸掺入到自体黑素细胞悬液中，增加细胞的黏

度，并还可以促进黑素细胞的生长和增殖。近年来，有报告使用羊膜作为移植载体，可用于黑素细胞移植。将培养扩增后的细胞转移到该膜上，培养后应用到色素脱失部位,取得95%以上的复色率[7]。本研究不同于以往组织工程的概念，将卡波姆胶引入作为黑素细胞的载体系统，可以起到很好的固定作用，从而解决现有的黑素细胞移植过程中细胞悬液易流失的问题，减少黑素细胞的流失量，提高植入率并且不会对黑素细胞造成损伤，在临床应用中，操作简单安全。另外，由于该化合物本身是优良、安全的高分子材料和药用辅料，型号多样，可适应多种剂型的特点，如作为凝胶基质、生物黏附材料、缓控释骨架材料等，在药学领域已经广泛应用[8]，加之具有廉价、容易获得的特点，经以上前期实验研究结果证实，对于用于黑素细胞涂布法移植的临床实施具有十分广阔的应用前景。

［1］Swope VB,Medrano EE,Smalara D,et al.Long-term pro1iferation of human melanocytes is supported by the physiologic mitogens alpha-melanotropin endothelin-l，and basic fibroblast growth factor.Exp Cell Res,1995,217:453-459.

［2］中华人民共和国药典（2000年版2部）[M].北京：化学工业出版社，2000：133.

［3］Olsson MJ,Juhlin L.Leucoderma treated by transplantation of a basal cell layer enriched suspension[J].Br J Dermatol,1998,138:644-648.

［4］Eves PC,Bullett NA,Haddow D,et al.Simplifying the delivery of melanocytes and keratinocytes for the treatment of vitiligo using a chemically definedcarrier dressing[J].J Invest Dermatol,2008,128:1 554-1 564.

［5］Lin SJ,Jee SH,Hsaio WC,et al.Formation of melanocyte spheroids onthechitosan-coatedsurface[J].Biomaterials,2005,26:1413-1422.

［6］van Geel N,Ongenae K,DeMilM,et al.Modified technique of autologous noncultured epidermal cell transplantation for repigmenting vitiligo:a pilot study[J].Dermatol Surg,2001,27:873-876.

［7］Redondo P,del Olmo J,García-Guzman M,et al.Repigmentation of vitiligo by transplantation of autologous melanocyte cells cultured on amniotic membrane[J].Br J Dermatol,2008,158:1 168-1 171.

［8］卢毅，张彤，陶建生.卡波姆在药剂学中的应用[J].中国医药工业杂志[J]，2007，38（6）：457-460.