鸡传染性支气管炎病毒上海株的分离与鉴定

朱英奇，李 露，王世传，陈宗艳，李传峰，刘光清

(1.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.江西农业大学动物科技学院，南昌 330045；4.安徽省全椒县畜牧兽医局，全椒 239500)

鸡传染性支气管炎( Avian infectious bronchitis,IB) 是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起的鸡一种急性、高度接触性传染病。鸡群感染IBV后，可以对呼吸道、泌尿生殖系统或消化系统造成严重损伤，对养鸡业的威胁比较大[1]。雏鸡主要表现为高发病率和死亡率，成年蛋鸡和种鸡的病死率虽然比较低，但是由于可发生产蛋显著下降，产软壳蛋、畸形蛋以及孵化率下降等，给养禽业造成的损失更大[2,3]。 因此，鸡传染性支气管炎一直是养鸡企业重点防范的重要疫病之一[4]。但是，由于IBV血清型众多，不同血清型之间交叉保护效果差，基因组的不断变异和重组情况也不断出现，使得鸡传染性支气管炎的防控形势十分严峻[5,6]。因此，当疫情发生时，及时进行病原分离和鉴定，对于正确防治鸡传染性支气管炎具有重要的指导意义。2011年，上海市附近某规模化养鸡场持续发生以呼吸障碍、产蛋下降和产畸形蛋为主要特征的疫病。我们通过临床诊断、病毒分离和鉴定，确定该疫情是由传染性支气管炎病毒感染引起，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 鸡胚及雏鸡 9～11日龄SPF鸡胚和1日龄雏鸡购自上海家禽育种有限公司；新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）Lasota 毒株为上海兽医研究所禽病实验室保存。

1.2 病毒的分离 无菌取具病鸡肺和肾脏，将病料1:5加灭菌生理盐水研磨成乳状，反复冻融3 次，10 800×g，4℃离心30 min ，取上清，用0.22μm微孔滤膜除菌。经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚接种0.2 mL，37℃孵育，弃去24 h内死亡鸡胚。96 h后，无菌收集尿囊液再接种10日龄SPF鸡胚，如此连传3代。

1.3 鸡胚半数感染量(EID50)的测定 取30枚10日龄SPF鸡胚，分6组，每组5枚鸡胚。将病毒液稀释成10-2～10-7倍，每个稀释度接种5枚SPF鸡胚，0.2 mL /枚。每天照蛋2次，观察鸡胚状况并记录死亡情况，死亡鸡胚放4℃保藏。孵化至15日龄，无菌收集尿囊液。按Read-Muench方法计算EID50。

1.4 干扰NDV增殖试验 将10日龄SPF鸡胚分为3组，每组10枚。第1组鸡胚经尿囊腔接种分离株第5代鸡胚尿囊液毒（0.2 mL/胚），37℃孵化10 h 后，接种NDV Lasota株（0.2 mL/胚）；第2组与第1组同时接种NDV Lasota株（0.2 mL/胚）；第3组为生理盐水对照组；继续孵化48 h，无菌收集尿囊液，按常规方法测尿囊液的血凝效价。

1.5 动物回归试验 用第5代SPF鸡胚尿囊液毒以滴鼻途径接种15日龄SPF雏鸡10只，0.2 mL/只（EID50=10-5.3/0.2 mL），同时以10只同日龄雏鸡注射灭菌生理盐水，作为对照，连续观察10 d，剖杀所有未死亡试验鸡。

1.6 RT-PCR检测 根据GenBank中发表的IBV核苷酸序列（NC_001451），设计一对特异性引物，上游引物：5'-TGGATAGTGTGGGTTGCTG-3'，下游引物：5'-CCATCCTTA ATACCTTCCTC-3'，预期PCR产物为445 bp。

病毒RNA的抽提及cDNA第一链的合成按照文献[3]进行。PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；最后于72℃延伸10 min。取5 μL PCR进行琼脂糖凝胶电泳，最后PCR产物进行测序分析。

2 结果

2.1 病毒的分离 对两份来自不同鸡舍的的病料进行鸡胚分离，结果表明病毒盲传3代后出现死亡，主要集中在48～96 h，可见头颈部、胸部、腿部等处出现点状出血（图1b-c），未死鸡胚则出现典型变化，表现为胚体发育受到抑制，出现侏儒胚，胚体卷曲（图1d），胚腹腔有明显的尿酸盐沉积等特征性病理变化。

图1 SPF鸡胚接种病毒后的特征性病变Fig.1 The gross lesion of SPF chicken embryos inoculated with the isolated virus

2.2 鸡胚半数感染量(EID50)的测定 将病毒液稀释成102～107倍，每个稀释度接种5枚SPF鸡胚，0.2 mL/枚，37℃孵化5 d。按照Read-Muench方法计算该病毒的EID50的值为5×105.3。

2.3 NDV增殖干扰试验 HA结果显示，第1组鸡胚尿囊液的平均血凝价为29，第2组鸡胚尿囊液平均血凝效价为211，说明分离毒株可以明显影响NDV在鸡胚中的复制，能使其血凝效价降低2个滴度，与以往报道的情况一致。

2.4 动物回归试验 用分离病毒的尿囊液接种15日龄SPF鸡以后，d4感染鸡开始出现咳嗽、精神沉郁、喷嚏，羽毛凌乱，两翅下垂，拉白色水样稀粪等症状。d5出现死亡，病死率20%。对病死鸡进行解剖，可见气管内有大量粘液，喉头出血，肾脏肿大，呈典型的花斑肾，输尿管和肾小管内充满尿酸盐结晶等肾型传染性支气管炎的特征病理变化。而对照组则没有明显病理变化。

2.5 RT-PCR检测及序列测定结果 分别取攻毒组死亡鸡和对照组鸡肺脏和肾脏匀浆，反复冻融3次后，组织液进行RT-PCR检测，结果在攻毒组鸡肺脏和肾脏中扩增出预期大小的PCR产物（图2）。

图2 RT-PCR检测结果Fig.2 The detection results of RT-PCR

利用BLAST程序，将测得的序列进行网上比对，发现它与冠状病毒科中的鸡传染性支气管炎病毒具有较高的亲缘关系。其核苷酸与CK/CH/LDL/05III、CK/CH/LHLJ/06II、CK/CH/LGD/96I、HZ等分离株的同源性最高，达99%；与CK/CH/SD09/001、GXNN6、CK/CH/LHLJ/99I、LX4等分离株的同源性稍低，为95%。

3 讨论

鸡传染性支气管炎是高度接触性传染病，该病自1937年被正式报道以来，世界各国已分离并鉴定出许多不同血清型的IBV，且每年都有新的血清型出现。由于鸡传染性支气管炎的临床症状复杂，病原血清型较多，且彼此之间的交叉保护率较低，给疫病防治带来很大困难，致使IB疫情绵延不断，一直得不到很好的控制。最近，上海市某养鸡场不断发生以产蛋下降和呼吸障碍为特征的疫情，给生产带来较大损失。接到疫情报道后，我们实验室从临床发病鸡肾病料中分离到1株病毒，经HA试验、电镜观察、理化特性测定、血清学鉴定和动物回归试验等多种试验方法检测，确诊为肾型鸡传染性支气管炎病毒。用该分离株的第5代SPF鸡胚尿囊液接种非免疫鸡，可复制出与自然发病鸡相同的临床症状，尤其以肾脏肿大、呈花斑样和输尿管中有多量白色尿酸盐沉积为明显特征，表明此毒株具有很强的嗜肾性，与以往报道的肾型传染性支气管炎病毒嗜肾毒株特征一致[7]，证实本次分离的病原为传染性支气管炎病毒嗜肾毒株。

因IBV核蛋白（N）基因在各型毒株间相对保守，常作为PCR检测的靶基因[8]，本试验即以参考毒株的N基因序列设计了一对特异性引物，并从疑似病料中扩增出了预期大小的基因片段，经序列测定，证实为传染性支气管炎的特异性核酸序列。将该分离株的N基因序列与GenBank中登录的多株国内外参考毒株进行比对，发现其与国内流行毒株：CK/CH/LDL/05III、CK/CH/LHLJ/06II、CK/CH/LGD/96I、HZ等分离株的核苷酸同源性均比较高。鉴于N基因是比较保守的核蛋白基因，因此可以根据其序列对IBV进行基因分型。探讨IBV SH11株与参考毒株之间的遗传演化关系、致病特性和抗原变异等方面的研究将是我们下一步的研究方向。

[1] B W 卡尔尼克.禽病学[M].10版.高福, 苏敬良, 译.北京：中国农业出版社, 1999: 653-665.

[2] Liu S W, Kong X G.A new genotype of nephropathogenic infectious bronchitis virus circulating in vaccinated and non-vaccinated flocks in China[J].Avian Pathol, 2004,33(3): 321-327.

[3] Liu S W, Zhang Q X, Chen J D,et al.Genetic diversity of Avian infectious bronchitis coronavirus strains isolated in China between 1995 and 2004[J].Arch Virol, 2006,151(6): 1133-1148.

[4] Liu S W, Chen J F, Chen J D,et al.Isolation of avian infectiou bronchitis coronavirus from domestic peafowl(Pavo cristatus) and teal（Anas）[J].J Gen Virol, 2005,86(Pt3): 719-725.

[5] Gelb J Jr, Wolff J B, Moran C A.Variant serotypes of infectious bronchitis virus isolated from commercial layer and broiler chickens [J].Avian Dis, 1991, 35(1): 82-87.

[6] Gelb J Jr, Keeler C L Jr, Nix W A,et al.Antigenic and S-1 genomic characterization of the Delaware variant serotype of infectious bronchitis virus [J].Avian Dis, 1997, 41(3):661-669.

[7] 邝荣禄.鸡传染性支气管炎肾病变型在广东的发现[J].养禽与禽病防治, 1982,1(3): 44.

[8] 何长生, 魏建忠, 王桂军, 等.鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定[J].中国预防兽医学报, 2004, 26(1): 39-41.