密码子优化型鹅细小病毒病毒样颗粒的表达与鉴定

陈宗艳，李传峰，高景鹏，朱英奇，王玢瑸，杨宗伟，刘光清

(中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)

鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）能引起雏鹅发生一种急性或亚急性的败血性传染病，以急性肠炎以及心、肝、肾等实质脏器发生炎症为主要特征，病死率较高，俗称“小鹅瘟”[1,2]。GPV为细小病毒科依赖病毒属成员，基因组为单股线性DNA，由5106个核苷酸组成，含有2个主要开放阅读框架（open reading frame, ORF）[3,4]。ORF1编码2个非结构蛋白：Rep1和Rep2，ORF2编码3个结构蛋白：VP1、VP2、VP3。其中，VP2基因全长1764 bp，是组成GPV衣壳的主要成分，可以自我装配成病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）[5,6]。此外，研究表明，VP2内含有病毒的主要抗原决定簇，可以诱导机体产生免疫反应，同时也是中和抗体作用的靶蛋白[7]。

由于GPV具有严格的种属特异性，无合适的传代细胞系培养。因此，不能用传统方法研制其细胞灭活疫苗。通过禽胚连续传代方法，致弱GPV以研制的弱毒疫苗则存在毒力返强的潜在风险，同时生产成本也偏高，加之种鹅和雏鹅所用疫苗不同，大大限制了此类疫苗的生产和应用。因此，研制新型GPV疫苗已成为必然趋势[8,9]。大量研究证明，VLPs在形态上与真正病毒粒子相同或相似，可以模拟成熟病毒刺激机体产生强烈的特异性体液免疫和细胞免疫；此外，由于VLPs不含有核酸，在体内无引发感染和发生病毒基因与宿主染色体基因整合等优点，因此，以之作为预防性疫苗非常安全，具有较好的应用前景[6,10]。本研究即根据GPV VP2蛋白可以自我组装成VLPs的特性，利用Bac-to-Bac表达系统在昆虫细胞中表达GPV的病毒样颗粒。同时，为了提高VLPs的表达量，我们还对VP2的密码子进行了优化，并鉴定了所表达的蛋白。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统、转染试剂Cellfectin及Grace昆虫细胞培养基购自美国Invitrogen 公司；pMD18-T 载体、Primer star聚合酶、限制性内切酶、PCR 引物均为大连TaKaRa 公司产品；鼠抗鹅细小病毒GPV VP2抗体由本实验室制备；ECL Western blot Substrate试剂盒购自Thermo scientific公司；山羊抗小鼠IgG购自北京中衫金桥公司。

1.2 VP2 基因的克隆 根据GenBank (登录号：JF333590)中的GPV VP2 基因序列设计引物，并在引物两端分别加上EcoRⅠ及Hind Ⅲ酶切位点。运用常规PCR方法，使用Primer star聚合酶扩增VP2 基因，然后克隆至pMD18-T载体中，获得重组质粒pMD-rVP2，将其送至上海基因生物技术公司进行测序鉴定。

根据昆虫细胞对密码子的偏嗜性，对GPV VP2基因进行优化，然后将密码子优化的VP2基因送交南京金斯特生物工程公司合成，并克隆至pMD18-T载体，获得重组质粒pMD-mVP2。

1.3 重组杆状病毒表达载体Bac-VP2的构建 首先，使用EcoRⅠ 、Hind Ⅲ双酶切重组质粒pMD-rVP2和pMD-mVP2，然后将释放出的VP2 基因插入pFastBac1质粒载体中，分别得到重组质粒pFast-rVP2 和 pFast-mVP2。 再 将 pFast-rVP2 和pFast-mVP2分别转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E. coli DH10Bac 感受态细胞，通过与Bacmid发生位点特异性转座，获得两种重组杆状病毒表达质粒Bacmid-rVP2和Bacmid-mVP2。采用PCR 方法对上述重组质粒进行鉴定，预期扩增产物为4064 bp。 引 物 序 列：M13F：5'-gttttcccagtcacgac-3'，M13R：5'-caggaaacagctatgac-3'。扩增条件： 93℃预变性 3 min； 94℃ 变性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 5 min，共30个循环；72℃ 延伸7 min。

1.4 重组杆状病毒rBac-VP2 的制备及病毒滴度测定 按照Bac-to-Bac表达系统说明书，将鉴定正确且纯化除菌的Bac-rVP2和Bac-mVP2分别用转染试剂（Cellfectin）转染对数生长期的Sf9 细胞，27℃培养5 d，待出现典型致细胞病变效应（cytopathic effect ，CPE）时收获第1 代重组杆状病毒，分别命名为Bac-rVP2、Bac-mVP2。随后，再用收获的第1代病毒感染Sf9 细胞，扩增并获得高滴度的第2 代重组病毒。用终点稀释法测定重组病毒的滴度，具体程序：将rBac-rVP2和rBac-mVP2分别进行10倍梯度稀释，感染96 孔板Sf9 细胞，27 ℃ 培养5 d 后，在显微镜下观察并记录发生CPE 的孔数，对于临界稀释倍数的所有孔(该稀释倍数病毒感染孔中有部分孔发生CPE)用免疫荧光法检测VP2 的表达（参见1.5），以进一步确定有发生病毒复制的孔数，利用下列公式来计算病毒滴度:

[病毒复制孔数/（该稀释度总孔数×单孔病毒液体积）]×稀释倍数。

1.5 VP2 在Sf9 细胞中的表达与检测 分别用第2代rBac-rVP2和rBac-mVP2以10倍感染复数（multiplicity of infection，MOI)）接种2份Sf9细胞，27℃培养72 h后，一份用于SDS-PAGE 及Western blot检测，另一份用于IFA检测。IFA试验过程如下：Sf9细胞去除上清后，加入冷固定液 （甲醇与丙酮1:1混合，-20℃保存）固定15 min，吸去固定液，用含1% BSA的PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min；加入稀释的鼠抗VP2 蛋白抗体（1:200稀释）37℃孵育1 h，漂洗3次，每次5 min；加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG （1:100稀释），37℃孵育1 h，漂洗3次后于荧光显微镜下观察、拍照。

1.6 GPV VLPs 的纯化及电子显微镜鉴定 10 MOI Bac-mVP2感染Sf9 3～4 d，待细胞病变明显，收集细胞；超声破碎后，于15 000×g 离心10 min，除去细胞碎片；将上清转移至铺有蔗糖（40%，W/W；TNE配制）垫层的离心管中，于4 ℃、45 000 ×g （SW32 Ti 转子，Beckman）离心3 h。超离后的沉淀用TNE缓冲液重悬，接着使用非连续CsCl 梯度（1.15、1.20、1.25 g/mL；TNE配制）于4 ℃、160 000× g（SW41 Ti 转子，Beckman）离心15 h。分管收集白色致密条带，用TNE稀释后，再次于4 ℃、45 000× g （SW32 Ti 转子，Beckman）离心3 h除盐，溶解沉淀，使用磷钨酸负染，于透射电镜下观察VLPs。

2 结果

图1 密码子优化前后的基因序列Fig.1 The sequences of the original and codon-optimized VP2 genes

2.1 携带VP2 基因重组杆状病毒的制备 用常规PCR方法成功扩增出VP2基因，其长度为1776 bp。酶切鉴定与测序结果均证明扩增的VP2基因与参考序列一致，其氨基酸同源性为100%。将VP2基因及密码子优化的VP2基因（图1）分别亚克隆至pFastBac1中，成功获得pFast-rVP2和pFastmVP2。用此两种重组质粒分别转化DH10Bac 感受态细胞，获到Bac-rVP2和Bac-mVP2两种重组质粒。由于杆状病毒载体的基因组较大，远远超过靶基因的长度 (1764 bp)，因此，不便于利用限制性内切酶酶切的方法进行鉴定，在此，我们采用了说明书推荐的PCR 方法对重组质粒进行鉴定。检测结果表明，成功获得了携带VP2基因的重组杆状病毒（图2）。Bac-rVP2转染Sf9 细胞获得的第1 代重组杆状病毒Bac-rVP2感染Sf9 细胞后，得到第2代 Bac-rVP2，滴度为 3.5×107； Bac-mVP2转染Sf9细胞获得的第2代毒的滴度为8.5×107。将第2代Bac-rVP2、Bac-mVP2保存于-80℃备用。

2.2 GPV VP2 蛋白在昆虫细胞中的表达 10 MOI Bac-rVP2及Bac-mVP2感染Sf9 3～4 d后，用IFA法可检测到VP2在昆虫细胞中的表达。如图3所示，Bac-rVP2及Bac-mVP2 感染的Sf9细胞均出现特异的绿色荧光(图3a、3b)，而对照的Sf9细胞中未见荧光(图3c)。

图2 PCR法检测Bac-rVP2和Bac-mVP2结果Fig.2 PCR results of Bac-rVP2 and Bac-mVP2

图3 IFA法检测GPV VP2蛋白在昆虫细胞中的表达Fig.3 Detection GPV VP2 proteins expressed in Sf9 cells by IFA

将收获的重组病毒进行SDS-PAGE电泳，检测结果显示野生型VP2和密码子优化的VP2（mVP2）都得到了成功表达，其分子量均约为65 kDa (图4a)。Western blot检测结果则证明表达的VLPs不仅特异而且具有良好免疫原性 (图4b)。此外，根据SDS-PAGE电泳及蛋白免疫电泳结果也可推知，VP2的密码子优化后，其在昆虫细胞中的表达量获得了显著提高。

2.3 VLPs 的电镜观察 Bac-mVP2 感染Sf9 所收集的细胞，经离心纯化、负染，电镜观察，可见VLPs，背景清晰（图5）。

3 讨论

图4 rBac-rVP2及rBac-mVP2在昆虫细胞中表达的蛋白的SDS-PAGE(a)及Western blot(b)检测结果Fig.4 SDS-PAGE(a)and Western blot(b)analysis of Sf9 cell extracts expressing VP2 protein using a polyclonal anti-GPV mouse serum

由于GPV具有严格的种属特异性，目前尚无合适的增殖GPV的传代细胞系，因此, 通过体外培养方式获得GPV很困难，而制备相应的诊断抗原或有效新型疫苗的候选抗原，也只能凭借基因工程手段获得。研究表明，VP2是GPV最重要的免疫原基因，无论是在诊断和抗病毒感染方面都具有较大的开发潜力。所以大量获得具有良好免疫原性的VP2蛋白在GPV基础与应用研究方面都具有重要意义[7]。目前，用来生产VP2 蛋白的表达系统主要是原核表达系统和杆状病毒-昆虫细胞表达系统，前者虽然能大量表达VP2蛋白，但VP2自聚成VLPs的能力丧失，而且由于缺乏必要的翻译后修饰，重组蛋白的抗原性不如天然抗原优越，因此用原核细胞表达VP2蛋白具有一定的局限性。相比之下，以Bac-to-Bac 表达系统为代表的杆状病毒-昆虫细胞表达体系则具有与动物细胞类似的转录、翻译及翻译后加工等优势，使得表达产物能拥有接近天然蛋白的生物学活性[5,6]。因此，该系统被广泛用于外源蛋白的表达，并逐渐发展为成熟的商品化的真核表达系统。

图5 电子显微镜观察mVP2形成的VLPs（53 000×）Fig.5 Electron micrographs of GPV VLPs derived from mVP2 (53 000×)

Ghislaine等[5]首次利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达了GPV VP2蛋白，并获得了具有良好免疫原性的VLPs，但其不足之处是蛋白的表达量偏低，限制了该抗原的扩大生产。我国是水禽养殖业大国，GPV感染对我国的水禽养殖业构成了较大威胁[11]，无论是快速诊断GPV感染，还是预防GPV疫情，都需要大量制备具有良好免疫原性的GPV抗原。为适应这一生产需要，根据昆虫细胞密码子的偏嗜性，我们尝试通过优化GPV VP2密码子的方法，以改变tRNA作用强度增加合成基因的表达量[12]，克服天然VP2蛋白在昆虫细胞中表达量偏低的局限性。通过比较昆虫细胞及GPV的密码子使用频率表，发现其中编码Ala、Asp、Leu、Lys、Val氨基酸的密码子使用频率差异超过13次以上，我们推测由于GPV基因密码子的偏嗜性与所选表达宿主细胞的tRNA含量不匹配，可能是导致GPV VP2在昆虫细胞中表达受到限制的原因。据此，我们在不改变GPV VP2氨基酸序列的前提下，将其密码子替换为昆虫细胞偏嗜的密码子，并根据影响表达的其他因素作个别位点调整，如降低VP2的GC含量，消除VP2编码区内可能导致翻译提前终止的潜在加尾信号（AT富含区）等抑制元件[13]。

本研究结果证实，在不改变VP2氨基酸序列的前提下，通过优化VP2密码子途径以提高其在昆虫细胞中的表达量是可行的。虽然，我们没有对表达产物进行定量分析，但是根据SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果，仍能判断密码子优化的VP2的表达量要远远高于野生型VP2的表达。此外，间接免疫荧光检测和蛋白免疫电泳试验结果也显示，本研究表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性。更重要的是，通过电子显微镜观察，发现密码子优化的VP2 蛋白能够在昆虫细胞中自行装配成VLPs，其直径为20～30 nm，形状大小与全病毒粒子相似。这说明密码子的优化不仅不影响VP2的折叠功能，而且可以显著提高其表达量。

综上所述，本研究通过优化GPV VP2密码子，实现了VP2蛋白在昆虫细胞的大量表达，并成功获得了具有良好免疫原性的密码子优化型VLPs，为进一步建立检测GPV感染的血清学方法以及研制有效的基因工程疫苗等奠定了良好基础。

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