日本脑炎病毒NS3基因截短表达及其在神经细胞定位研究

邓绪芳，史子学，魏建超，邵东华，王少辉，李蓓蓓，马志永

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

日本脑炎又称流行性乙型脑炎，是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一种严重损害中枢神经系统的人畜共患传染病，可引起人的致死性脑炎，重症患者康复后有严重的神经系统后遗症。该病主要流行于东南亚，在中国除青海和新疆外，其他省均有流行。自使用弱毒疫苗免疫预防后，中国该病的发病率显著降低，得到了很好的控制[1]，但每年仍有一定数量的发病病例。据世界卫生组织（WHO）估计，目前全球每年报告的发病人数在5万例左右，其中约1/3的病例死亡，存活者20%～40%留有神经麻痹和心理改变等严重后遗症[2]。因此，开发治疗性的抗病毒的药物显得尤为重要[3]。

JEV基因组全长10 976个核苷酸，除5'端95个核苷酸和3'端585个核苷酸为非编码区外，其余10 296个核苷酸形成一个开放阅读框（open reading frame, ORF），编码一个3432个氨基酸的多蛋白前体，经过酶切形成3个结构蛋白（C、prM和E）和 7个非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）[1]。NS3是黄病毒科中最保守的非结构蛋白，至少具有3种酶活性，参与了病毒蛋白的水解加工以及病毒的复制，是病毒复制的必需蛋白。NS3蛋白已成为研究抗该病毒药物的重要靶标分子[4]。在本研究中，我们克隆了NS3基因C端，在大肠杆菌中获得高效表达，并制备了抗NS3的多克隆抗体，利用该抗体观察了NS3在神经细胞中的亚细胞定位，为进一步研究JEV的致病机制提供有价值的数据。

1 材料与方法

1.1 材料 JEV为本研究室的猪源分离株（病毒滴度为4×108PFU/mL）；大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）、原核表达载体pET-28a（+）为本室保存；小鼠神经瘤母细胞系Neuro-2A（ATCC No.CCL-131）购自中国科学院细胞库；昆明系小鼠购于中科院上海实验动物中心；rTaq酶、AMV反转录酶、各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、TA克隆试剂盒均购自大连宝生物公司；质粒提取和DNA片段回收试剂盒购自天根生物技术公司；His-Band 蛋白质纯化试剂盒购自Novagen公司；HRP标记羊抗小鼠IgG二抗和FITC标记羊抗小鼠IgG二抗购自Santa Cruz公司；羊抗小鼠IgG Alexa Flour 594二抗购自Invitrogen公司；其他所需试剂和溶液参照《分子克隆实验指南》准备。

1.2 方法

1.2.1 NS3基因C端（NS3C）的克隆与原核表达 根据GenBank已发表的日本脑炎病毒全基因组序列（登录号：AF315119）设计NS3基因C端（955～1857 bp）特异性引物，上下游引物分别引入EcoR I和Sal I位点：上游5'-ATGGAAAATTTTCATGCC GCCTGGAACCACGG-3'；下游5'- GCGGTTCCGGAACTTAT CTCTTCCCTGC TGCA-3'。

提取JEV感染Vero细胞total RNA，RT-PCR产物经琼脂糖电泳分离，试剂盒快速回收DNA片段。DNA片段经克隆测序验证后，构建重组表达载体pET-28a-NS3C，并转化BL（DE3）细菌，用IPTG诱导后，12%SDS-PAGE分析蛋白表达。

1.2.2 原核表达产物的纯化及动物免疫 将1.2.1中鉴定表达的重组阳性克隆菌扩大培养，裂解细菌提取包涵体，用His-Band Ni+柱进行亲和层析纯化。纯化的His-NS3C蛋白免疫昆明系小鼠（50～100μg/只）。初免用重组蛋白与完全弗氏佐剂（1:1），二次免疫用重组蛋白与不完全弗氏佐剂（1:1），以后直接免疫重组蛋白。连续免疫4次，间隔2周，末次免疫后7 d采血分离血清。

1.2.3 细胞感染病毒 Neuro-2A或Vero细胞用DMEM（含10%胎牛血清）培养。当细胞生长到50%～70%密度时感染病毒，37℃吸附90 min，用PBS轻柔漂洗2次，再加入维持培养液（含1%胎牛血清DMEM）。感染24 h后，收获细胞，进行Western blot和间接免疫荧光试验。

1.2.4 抗血清特异性鉴定 抗血清特异性鉴定采用间接免疫荧光效价（indirect immunofluorescence assay, IFA）和Western blot方法，详细步骤均见参考文献[5]。

1.2.5 小鼠攻毒 取约1周龄的昆明系乳鼠6只：攻毒组3只乳鼠，将乙脑种毒液用PBS适度稀释，每只小鼠腹腔注射病毒液0.25 mL（含病毒1.0×106PFU）。对照组小鼠3只，腹腔注射同样体积的PBS。攻毒后每天观察，当攻毒组小鼠出现明显神经症状时，分别取攻毒组和对照组小鼠脑组织，进行免疫组化试验。

1.2.6 免疫组化 组织固定按照常规进行，新鲜组织用10%中性甲醛固定24 h后脱水，石蜡包埋，5μm连续切片，切片烘干后4℃备用。免疫组化采用DAB显色。切片经0.3%H2O2灭活内源性过氧化酶，抗原修复后用10%山羊血清封闭，然后逐步进行一抗和二抗孵育、DAB显色，封片后在光镜下观察。

2 结果

2.1 NS3C克隆和原核表达载体的构建 NS3基因位于JEV基因组4608～6464 bp间，全长为1857 bp，编码68～70 kDa蛋白。本研究为了获得针对NS3的抗体，用DNAStar-Protean软件分析了NS3蛋白的抗原性（图1），截取了抗原指数和亲水性分值较高的C端（319～619 aa）进行表达。将JEV感染Vero细胞24 h后收取细胞样品，提取总RNA进行反转录，以cDNA为模板扩增编码NS3蛋白C端的基因片段（约900 bp）（图2A）。将PCR扩增的片段插入TA克隆载体pMD-18T中测序，测序正确后，双酶切下NS3C片段并插入pET-28a(+)载体，命名为pET-28a-NS3C（图2B）。

2.2 NS3C在大肠杆菌中的表达及纯化 将重组表达质粒pET-28a-NS3C转化BL21(DE3)，挑取单细菌进行诱导表达，结果发现在诱导细菌中有大小约38 kDa的蛋白条带，与目的蛋白大小相符（图3）。将成功获得表达的重组菌扩大培养，使用His-Band蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行提纯。软件分析显示纯化的重组蛋白纯度达到95%（图3）。

图1 NS3示意图及其部分特性分析Fig.1 NS3 and its characteristics

图2 NS3C克隆及其重组表达载体的构建Fig.2 Cloning of NS3C and construction of its recombinant expressing plasmid

图3 NS3C重组蛋白的表达与纯化Fig.3 Expression and purification of NS3C

2.3 NS3C抗血清的制备及特异性鉴定 将重组蛋白免疫昆明系小鼠，5免后收取血清。取等量的感染和未感染JEV的Vero细胞蛋白样品进行Western blot分析，一抗为适当比例稀释的NS3C抗血清，化学发光法进行显色。如图4所示，在JEV感染组出现一条大小约72 kDa大小的条带，与预计NS3蛋白大小相符，而未感染细胞样品（mock）中没有相应的条带出现，说明该抗血清能特异识别病毒感染细胞中的NS3蛋白。

图4 NS3C抗血清识别病毒感染Vero细胞中的NS3蛋白（Western blot）Fig.4 NS3C antiserum reacted with NS3 expressed in JEV-infected Vero cells (Western blot)

将96孔中的Vero细胞感染JEV，24 h后固定，进行IFA分析，一抗为适当比例稀释的NS3C抗血清。荧光显微镜观察发现在JEV感染组细胞中有特异性亮绿色荧光，而且主要集中在胞浆中，而未感染组细胞（mock）仅见微弱的绿色背景，无亮绿荧光（图5），表明抗血清能特异识别病毒感染细胞中的NS3蛋白。

2.4 NS3在小鼠神经母瘤细胞中的亚细胞定位 JEV具有嗜神经特性，能在神经元细胞中复制并引发细胞凋亡。本试验将JEV感染小鼠神经瘤母细胞系Neuro-2A，用NS3C抗血清检测NS3蛋白的亚细胞定位。从图6可以看出，NS3蛋白主要定位于细胞质中，且可在细胞延伸出的突触中检测到（图6A，箭头指示）。进一步观察发现，NS3蛋白在细胞核周围分布明显（图6D，箭头指示）。

2.5 NS3在小鼠大脑神经细胞定位 JEV感染小鼠的脑组织石蜡切片，用NS3C抗血清进行免疫组化染色，观察NS3在脑组织中的表达定位。显微镜观察发现，在大脑免疫组化切片中可以看到NS3染色明显（棕褐色），多种细胞中呈现NS3染色，主要细胞为椎体神经元细胞，NS3主要定位于胞浆（图7A和7B，箭头所示）。而未感染小鼠脑组织切片内，未观察到明显棕褐色染色（图7C和7D）。

3 讨论

图5 NS3C抗血清识别病毒感染细胞中的NS3蛋白（IFA）Fig.5 NS3C antiserum reacted with NS3 expressed in JEV-infected Vero cells (IFA)

日本脑炎病毒是一个具有重要公共卫生学意义的病原，开发抗该病毒的治疗性药物具有重要的意义。由于JEV的非结构蛋白在病毒的复制中发挥重要的作用，因此这些非结构蛋白成为药物靶标分子的重要研究对象。

图6 NS3蛋白在小鼠神经母瘤细胞Neuro-2A中的亚细胞定位Fig.6 Subcellular localization of NS3 protein in Neuro-2A

图7 免疫组化分析NS3在小鼠大脑神经细胞定位Fig.7 Localization of NS3 in mouse brain by immunohistochemistry assay

NS3是一个多功能蛋白，至少具有3种酶活性：丝氨酸蛋白酶活性、核苷酸磷酸酶活性（NTPase）和RNA解旋酶活性（helicase）[6,7]。其中，丝氨酸蛋白酶活性位于蛋白N端，NTPase和helicase活性位于蛋白的C端。研究者们以NS3蛋白的这些酶活性作为靶标，开始抗病毒研究。此外，有研究报道HCV NS3蛋白与肿瘤抑制因子p53蛋白有相互作用，具有抗凋亡功能，并能够抑制p53的生物学活性[8,9]。这些数据都表明，NS3蛋白在病毒复制过程中，不仅作用于自身，也作用于其宿主细胞因子。遗憾的是，这些作用的详细机制尚未明了。

为了获得高效表达的重组蛋白和特异性好的抗体，用于开展NS3与宿主细胞的互作的研究，我们分析了NS3蛋白的抗原性和亲水性，选择克隆了NS3基因的C端，并在大肠杆菌中获得了高效表达。通过免疫小鼠，成功研制出具有良好特异性的抗血清，为进一步研究NS3生物学功能提供了有利的工具。我们利用所制备的NS3C抗血清初步分析了NS3蛋白在神经细胞内的亚细胞定位，观察到NS3主要定位于细胞质中，并也可在神经细胞的突触中检测到NS3，这些结果为研究NS3蛋白的生物学功能提供了参考。

[1]殷震, 刘景华. 动物病毒学[M]. 2版. 北京：科学出版社，1997：631.

[2]Mackenzie J S. The ecology of Japanese encephalitis by vaccination: Minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok,13-15 October 1998[J].Vaccine, 2000, 18(Suppl2):1- 25

[3]Gould E A, Solomon T, Mackenzie J S. Does antiviral therapy have a role in the control of Japanese encephalitis?[J]. Antiviral Res, 2008,78(1):140-149.

[4]曾雅梅, 肖明, 张楚瑜. NS3蛋白在黄病毒科病毒生命活动中的作用[J]. 中国病毒学, 2003,15(5):508-512

[5]王晓杜, 陈培君, 沈阳, 等. H3N2型猪流感病毒M2蛋白表达分析[J]. 生物工程学报, 2009, 26(1):16-21

[6]Paola G A, Debra B R, Chiara N A, et al. Multiple enzymatic activities with recombinant NS3 protein of hepatitis C virus [J]. J Virol, 1997, 71: 2583-2590.

[7]Kadare G Haenni A L. Virus-encoded RNA helicase [J]. J Virol, 1997, 7l(14): 2583—2590.

[8]Deng L, Fuji M N, Tanaka M, et al. NS3 protein of Hepatitis C virus associates with the tumour suppressor p53 and inhibits its function in an NS3 sequence-dependent manner [J]. J Gen Virol, 2006, 87(6):1703-1713.

[9]Tanaka M, Fuji M N, Deng L, et al. Single-point mutations of hepatitis C virus NS3 that impair p53 interaction and anti-apoptotic activity of NS3 [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 340(3):792-799.