两株H9N2亚型猪流感病毒全基因进化分析

葛菲菲，刘 健，鞠厚斌，杨德全，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

猪流感（swine influenza，SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起的一种重要的猪呼吸道疾病，在世界各地均有流行，给养猪业造成了很大的经济损失[1]。SIV 属正黏病毒科、A型流感病毒属。中国1994年从广东省分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV），此后，该亚型病毒在全国范围内广泛流行。H9N2亚型AIV不仅可以感染禽，而且也可以感染猪和人。震惊世界的97香港流感事件的发生，使人们认识到AIV可以不经过中间宿主的适应突破种间屏障而直接感染人，该事件中有18人感染H5N1亚型AIV，其中6人死亡[2]。H9N2流感病毒对人类的感染与H5N1亚型不同，H9N2亚型流感病毒比H5N1亚型流感病毒温和，可以感染人但不致人死亡。现已证明H9N2亚型AIV可以感染猪[3-6]，那么，它就有可能通过在猪这个中间宿主中的适应，产生适合在人体内繁殖的流感病毒，或者在猪体内与猪流感病毒和/或人流感病毒重组，产生可感染人的新的流感病毒，进而引起人类流感大流行。1931年Shope等[7]分离鉴定了第1株SIV。目前已发现H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、 H4N6、 H9N2 等 9种SIV亚型。SIV在猪群中的流行日趋严重，血清学和病毒学监测显示H1和H3亚型SIV在中国猪群中广泛流行，并且H9N2亚型SIV在猪群与人群中的流行也呈上升趋势[8,9]。猪既有禽流感病毒（Avain influenza virus，AIV）的表面受体，又有人流感病毒的表面受体[10]，是流感病毒的混合器，AIV和人流感病毒均可感染猪，所以猪在流感病毒的种间传播方面有重要意义。SI不仅严重妨碍养猪业的健康发展，同时也威胁着人类健康，具有重要的公共卫生学意义。本研究对H9N2亚型猪流感病毒河南株（Swine/Henan/Y1/09）和上海株（Swine/Shanghai/Y1/09）进行了全基因序列分析，为进一步防制猪流感的流行提供分子流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 病毒 Swine/Henan/Y1/09（H9N2）株简称SW/HN/Y1/09，2009年7月从上海一家屠宰场的猪群中分离到的，该猪群产地为河南；Swine/Shanghai/Y1/09（H9N2）株简称SW/SH/Y1/09，2009年12月从上海一家屠宰场的猪群中分离到的，该猪群产地为上海本地；两株毒株均由本中心分离保存。

1.2 全基因测序 根据GenBank收录的H9N2亚型流感病毒8个基因片段序列，分别设计扩增H9N2亚型8个基因片段的特异性引物。试剂盒提取病毒基因组RNA，具体步骤按照说明书进行。RT-PCR产物电泳经凝胶回收后，按pMD 18-T载体说明书进行连接、转化，用EcoR I和Hind III进行双酶切鉴定，鉴定为阳性克隆后送英骏生物有限公司测序。

1.3 基因cDNA核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析比较 借助DNA Star4.0分析软件，通过Jotun Hein方法分析比较所得序列的同源性以及一些关键位点的变化情况。

1.4 绘制系统发育树 借助MEGA3.1分析软件，确定这两个毒株8个基因片段的遗传分类情况。

2 结果

2.1 HA基因和NA基因全序列同源性比较以及一些关键位点的分析 两株猪流感病毒HA基因的同源性为96.6%，NA基因的同源性为98.6%。通过http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/分析表明，两株毒株HA1分子上具有7个共同的潜在糖基化位 点， 分 别 为 11、64、123、200、280、287和295位，在HA2分子上存在2个潜在的糖基化位点，为474和533位。表1为这两个毒株和已发表的8株H9N2亚型猪流感病毒HA裂解位点和受体结合位点处的特征性氨基酸分析[11]，HA裂解位点的序列表明均为非高致病性毒株。通过BLAST发现，Swine/Henan/Y1/09的HA基因片段与1999年分离的禽H9N2亚型流感病毒有较高的同源性，而NA基因片段与2009年分离的禽H9N2亚型流感病毒有较高的同源性。Swine/Shanghai/Y1/09的HA和NA基因片段均与2009年分离的禽H9N2亚型流感病毒有较高的同源性（表2）。

2.2 2株分离株的8个基因片段的遗传发生关系 这两个毒株的HA和NA基因均属于Ck/Bei/1/94系，而内部基因已发生重排。其基因片段组成与2008年上海地区分离的一株健康鸡群中分离的H9N2亚型毒株（Ck/Shanghai/Y1/2008）8个基因片段均分别属于同一个基因群（图1），表明流感病毒具有跨种间传播的生物学特征。

3 讨论

猪在流感病毒的种间传播过程中，扮演着中间宿主和多重宿主的角色，是人流感病毒与禽流感病毒发生基因重排和重组的重要场所，被认为是人流感病毒和禽流感病毒的混合器。在猪体内可以同时潜伏多种亚型的人、禽、猪流感病毒，发生基因重排和重组，产生新的流行毒株，在人群或畜禽中流行，所以对猪流感病毒进行研究具有重要的公共卫生学意义。本研究中两株H9N2亚型SIV的HA基因氨基酸序列分析均无缺失现象，HA裂解位点处为PSRSSR/GL，与表1中其余参考毒株的HA裂解位点不同，这两株H9N2亚型SIV HA裂解位点处均无多个连续的碱性氨基酸插入，具有典型的低致病性禽流感病毒的HA基因特征。HA氨基酸序列分析表明，这两株毒株HA1分子上具有7个共同的潜在糖基化位点，分别为11、64、123、200、280、287和295位；在HA2分子上存在2个潜在的糖基化位点，为474和533位。表1中10株H9N2亚型SIV在HA基因的受体结合位点上存在着显著的差异，所有毒株在183、227和228位受体结合位点上的氨基酸是N、Q和G；190位受体结合位点变化最大，可以是A、G、T或V；在受体结合位点的226位，我们的两株分离株为L，保持着人流感病毒的特征[11]；其他毒株在226位为Q或M。本研究中河南株的HA和NA基因是由1999年H9N2亚型禽流感毒株以及2009年H9N2亚型禽流感毒株重组形成，上海株的HA和NA基因来源于2009年H9N2亚型禽流感毒株，这两株毒株均为重组体，并与Ck/Shanghai/

Y1/2008有相同的起源。本研究为进一步了解中国禽源H9N2亚型SIV的遗传演化规律提供了相关基础材料。

表2 两株H9N2亚型猪流感病毒 HA和NA基因片段与参考株最高同源性比较Table 2 Genetic homology of the two H9N2 Swine influenza viruses with related sequences available in GenBank

图1 两株H9N2亚型猪流感病毒（Swine/Henan/Y1/09和Swine/Shanghai /Y1/09）8个基因片段进化树Fig.1 Phylogenetic trees of eight gene segments of two H9N2 subtype Swine influenza viruses（Swine/Henan/Y1/09 and Swine/Shanghai /Y1/09）

[1] Loeffen W L, Kamp E M, Stockhofe-Zurwieden N,et al.Survey of infectious agents involved in acute respiratory disease in finishing pigs[J].Vet Rec, 1999, 145 (5): 123-129.

[2] Claas E C, Osterhaus A D, van Beek R,et al.Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus[J].Lancet 1998, 351 (9101): 472-477.

[3] Peiris J S M, Guan Y, Ghose P,et al.Co-circulation of avian H9N2 and human H3N2 viruses in pigs in southern China[J].Int Congr Ser, 2001, 1219: 195-200.

[4] Cong Y L, Pu J, Liu Q F,et al.Antigenic and genetic characterization of H9N2 swine influenza viruses in China[J].J Gen Virol, 2007, 88(7): 2035-2041.

[5] Shi W F, Gibbs M J, Zhang Y Z,et al.Genetic analysis of four porcine avian influenza viruses isolated from Shandong, China[J].Arch Virol, 2008, 153(1): 211-217.

[6] Xu C, Fan W, Wei R,et al.Isolation and identification of swine influenza recombinant A/Swine/Shan dong /1/2003(H9N2)virus [J].Microbes Infect, 2004, 6(10): 919-925.

[7] Claas E C, Kawaoka Y, de Jong J C,et al.Infection of children with avian-human reassortant influenza virus from pigs in Europe [J] .Virology, 1994, 204(1): 453-457.

[8] 李海燕,于康震, 杨焕良, 等.中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定[J].中国预防兽医学报, 2004,26(1): 1-6.

[9] 李海燕, 于康震, 辛小光, 等.部分省市猪流感的血清型调查及猪流感病毒的分离与鉴定[J].动物医学进展,2003, 24(3): 67-72.

[10] Ito T, Couceiro J N, Kelm S,et al.Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential [J].J Virol, 1998, 72(9): 7367-7373.

[11] 于海.中国部分地区猪流感病毒的分子流行病学研究[D].中国农业科学院, 2008.