环扎大鼠脊髓损伤早期不同时机减压后光密度测量热休克蛋白70的表达及其与神经细胞凋亡的相关性研究

顾文浩 胡岚祥 徐祝军 王绪成 汪红林 谢家兵

脊髓损伤(SCI)的发病率随着现代交通业的发展而升高，手术减压治疗急性SCI是一种切实可行的治疗方法，但是在对SCI选择伤后干预性手术治疗时间点上，各临床治疗中心尚没有达成共识［1］。为探讨早期不同时机减压疗效，本实验采用环扎法建立大鼠脊髓损伤模型，对损伤的脊髓早期减压，应用免疫组化法观察HSP70的表达及TUNEL阳性细胞数，光密度测量脊髓细胞的 HSP70表达阳性面积，观察HSP70表达与神经细胞凋亡的关系，观察早期减压疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 84只雄性、13周龄、清洁级Sprague－Dawley大鼠，体重270～320 g，平均290.5 g。由浙江省实验动物中心提供，许可证号:SCXK(浙)20080033。使用随机数字表、安全随机法，分为4组。对照组即A组:仅行椎板切除，n=12，实验组分为B组:8 h脊髓减压，n=24;C组:72 h脊髓减压，n=24;D组:环扎术后不行脊髓减压术，n=24。分别于手术后 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 处死后取出脊髓标本。

1.2 主要试剂 (1)Rabbit Anti－Hsp70;(2)即用型SABC试剂盒;(3)细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);(4)0.01PBS(PH7.2－7.4);(5)0.01枸橼酸缓冲液(PH6.0);(6)DAB显色试剂盒;(7)胃蛋白酶消化液(北京中杉金桥生物有限公司);(8)4%甲醛(皖医弋矶山医院实验外科)。

1.3 动物模型建立 采用环扎法建立大鼠脊髓损伤模型［2］。以5－0普通白色丝线环扎大鼠胸腰段硬脊膜囊建立大鼠急性脊髓损伤压迫模型。1%戊巴比妥钠，30～40 mg/kg，大鼠腹腔内给药麻醉，以T13棘突为中心，取后入路，咬除T13椎板。10倍显微镜下，用测量线环形测量硬脊膜囊周长，测出硬脊膜囊周长(C1)，经代数运算(C 2 =C1×)获得将硬脊膜囊截面压缩至原截面积70%的周长(C2)，将原测量平面将硬脊膜囊环扎至原截面积的70%。结扎后依层缝合。B组8 h脊髓减压，取出环扎线;C组72 h脊髓减压，取出环扎线。D组保留环扎线。术后常规护理。

1.4 标本采集、制备与HE染色 大鼠模型分别在手术减压后 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 五个时间，将对照组和脊髓损伤组的大鼠经心脏灌注取材，灌注后脊髓已被多聚甲醛固定变硬，以环扎损伤部位为中心、取出其上下段共1.5 cm脊髓组织，浸泡于相同甲醛溶液中后固定72 h。损伤下端0.5 cm以4 μm厚度切片，脊髓取冠状面，捞片于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，标签晾干玻片分别行HE染色。

1.5 免疫组织化学染色 分别取脊髓损伤下端组织切片用Rabbit Anti－Hsp70抗体进行SABC免疫组织化学染色，使用DAB显色试剂盒，TUNEL法观察神经细胞的凋亡水平，使用DAB显色试剂盒染色检测，所有实验步骤严格按照该试剂的标准和流程进行。使用数码相机(NIKON－4300日本)对显色的图片摄像。

1.6 光密度测量 在普通光学显微镜(日本Olympus公司)下观察每组不同时间下染色特点。每一染色切片随机取5个高倍视野(10×40)进行显微摄影(Nikon Eclipse 80i显微成像系统)获取图像，调试完成后，维持采集的各项设置不变，一次性采集出所有样本的图像，每张切片至少随机采集5个视野。使用图像分析软件(Image－Pro Plus 6.0美国)对每张切片进行光密度测定。积分光密度(IOD)可反映所测结构的光密度与面积的综合变化，IOD与物质的质量成正比，其数值反映物质的相对含量［3，4］。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行数据分析，各组数据采用均数±标准差±s)表示，四组数据均呈正态分布，方差齐性检验采用比较均值单因素方差同性检验，组内组间比较采用一般线性模型单变量方差检验，HSP70阳性细胞数与神经细胞凋亡细胞数相关性采用直线相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSP70积分光密度 使用图像分析软件(Image－Pro Plus 6.0美国)对每张切片进行光密度测定，在400倍每张切片至少随机采集5个视野。A组偶见阳性面积，各时间点无显著差异。阳性面积D组高于C组，C组高于B组，实验组术后1 d阳性面积增加，术后3 d到达高峰，术后7 d有所降，术后21 d仍然有所表达。实验组组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，组内比较术后1 d、3 d、7 d差异有统计学意义(P＜0.05)，术后7 d、14 d、21 d比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 HSP70免疫组化阳性细胞数结果 光镜下分别观察各组各时间点脊髓损伤下端的组织变化，以细胞浆和(或)核棕黄色着色为阳性细胞，在400倍视野下每张切片于灰质取5个视野，分别计数每个视野的阳性细胞数。A组偶见免疫阳性细胞，各时间点无显著差异(见图1:A)。阳性细胞数，D组高于C组，C组高于B组，实验组术后1 d免疫阳性细胞增加，术后3 d到达高峰，术后7 d有所降，术后21 d仍然有所表达。实验组图片见图1:B、C、D、E、F。实验组组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，组内术后1 d、3 d、7 d比较差异有统计学意义(P＜0.05)，术后7 d、14 d、21 d比较差异无统计学意义(P＞0.05)。HSP70免疫阳性细胞数统计估算边际均值见图2。

2.3 Tunel凋亡细胞 凋亡细胞呈棕褐色和棕黄色，胞核固缩颗粒深染，形态不规则，为散在和弥散性分布于损伤区域及周围。在400倍视野下每张切片于灰质取5个视野，分别计数每个视野的阳性细胞数。对照组少见凋亡细胞。凋亡细胞数，D组高于C组，C组高于B组，实验各组术后1 d出现大量凋亡细胞，术后3 d达到高峰，术后7 d、14 d、21 d凋亡细胞逐日减少。各组组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，组内术后1 d、3 d、7 d比较差异有统计学意义(P＜0.05)，术后7 d、14 d、21 d比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 HSP70阳性细胞与Tunel细胞凋亡的相关性分析 实验组不同时间点热休克蛋白70阳性细胞、tunel阳性细胞数比较差异均具有统计学意义，两者线性相关系数r=0.685～0.971，对r值进行t检验的假设检验，P＜0.05，认为两者成正相关。

3 讨论

目前治疗脊柱脊髓损伤的主要方法是及时彻底地减压和恢复脊柱稳定性，减少继发性损伤［1］。目前认为细胞凋亡是继发性脊髓损伤的重要组成部分，继发性脊髓损伤中出现的神经元和神经胶质细胞死亡都是继发细胞凋亡的结果［5］。当发生脊髓损伤后局部热休克蛋白(HSPs)的表达增加，可对抗脊髓继发性损伤神经细胞凋亡是脊髓继发性损伤的主要机制之一，HSPs可通过以下机制抑制神经细胞凋亡:抑制内源性(线粒体内caspase依赖的)凋亡途径，抑制外源性(受体介导的)凋亡途径，调节Bcl－2家族成员的活性促进核转录因子的活化，抑制一氧化氮(NO)的大量产生减少自由基的毒性作用［6］。其中HSP70属于诱导型HSP70，其在正常细胞中不表达或表达量很少，但在应激源刺激下，表达量显著增加［7］。实验证实HSP70对细胞保护作用，其诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关［8］。邵将等［9］实验显示，HSP70表达随时间的延长逐渐增强，损伤后24～48 h达到顶峰，在此期间组织内所有细胞均可见HSP70的阳性表达，这种表达一直持续到损伤后72 h。与本次实验HSP70表达的高峰期较为接近。由于HSP70属于诱导型HSP，其诱导的机制尚不完全清楚，所以单纯手术干预不能诱导其表达增加。因此在今后的研究中，对损伤的脊髓早期减压的同时，短时间诱导出大量HSPs，达到更好地抗脊髓继发性损伤神经细胞凋亡，将是未来治疗脊髓损伤的新路径。

图1 热休克蛋白70免疫组化图片(400倍放大)

图2 热休克蛋白70的估算边际均值

［1］杨民，徐祝军，党耕町．外科干预性手术治疗时间的选择对急性脊髓损伤预后影响的研究进展［J］．中国脊柱脊髓杂志，2009，19(4):310－313．

［2］徐祝军，王兵，杨民．环扎法致大鼠脊髓损伤后早期不同时段减压疗效的评价［J］．中华实验外科杂志，2011，28(7):1191 －1192．

［3］李涛，范好，刘芳．免疫组织化学图像光密度分析的标准化方法［J］．解剖学杂志，2008，31(5):727 －728．

［4］李枫．图像分析中光密度参数物理意义的正确理解和使用［J］．解剖学杂志，2009，32(2):271 －273．

［5］范留欣，马龙，孙长山．大鼠脊髓损伤后MMP一9表达和细胞凋亡的研究［J］．中国医学创新，2010，7(25):175 －176．

［6］李健辉，冯世庆．热休克蛋白与脊髓损伤的相关性研究［J］．天津医药，2009，37(6):521 －523．

［7］朱林波，傅庆国．HSP70－PCs的抗肿瘤作用［J］．中华全科医学，2011，9(8):1281 －1282．

［8］Sale hi AH，Morris SJ，Ho WC，et al．AEG3482 is an antiapoptotic compound that inhibits Jun kinase activity and cell deathth rough induced expression of heat shock protein70［J］．ChemBio，2006，13(2):213－223．

［9］邵将，贾连顺，曹师锋，等．热休克蛋白70在大鼠急性打击损伤脊髓中的表达［J］．脊柱外科杂志，2008，6(3):169 －172．