紫花苜蓿航天诱变田间形态学变异研究

杨红善，常根柱，包文生，柴小琴，周学辉

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州730050；2.甘肃省航天育种工程技术中心，甘肃 天水741030；3.天水市农业科学研究所，甘肃 天水741001）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生的优良豆科牧草，具有优质高产，营养价值高，生产潜力大，适应性广等特点，在我国西部半干旱地区具有十分重要的价值和地位，苜蓿产业被誉为“牛奶生产的第一车间”。按科学标准，用苜蓿干草饲喂奶牛，可使原料奶的乳蛋白率达到3.0%以上，乳脂率达到3.5%以上，这个指标可以大大超过当前的国家标准（2.75%），并与国际标准接轨。

航天诱变育种是以高科技返回式卫星为背景的新兴育种方法，其目的是利用空间的特殊环境使种子产生变化，引起生物体染色体畸变，进而导致生物体变异，获得有益突变，在地面选育新种质、新材料、培育新品种的植物育种技术［1－12］。航天育种具有变异频率高、变异幅度大、有益变异多、稳定性强，优势明显等特点。航天诱变的机理是高真空、微重力、空间辐射及太空未知诱因的综合作用；包括以下三方面：1）宇宙射线、高能离子、宇宙其他物质照射种子胚芽→导致DNA双链断裂重组→导致遗传信号改变；2）航天器上升、回落、失重、失重时间、微重力改变染色体结构使得紧凑螺旋状的染色体拉长→导致遗传信号改变；3）其他许多太空未知诱因（正在研究）。航天诱变是一个多因素综合作用的结果，是地面无法模仿的，具有其特殊性。

我国是世界上第三个掌握了返回式卫星技术的3个国家（俄国、美国、中国）之一，在开展空间诱变研究方面具有得天独厚的优势，航天育种在我国自1987年开始尝试性研究，经过20多年的质疑、艰辛、探索，至今已被广大农业工作者认可，目前航天育种已在国内形成一种大的趋势快速向前发展。至今，已通过国家或省级鉴定的小麦（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）、辣椒（Capsicumspp.）、番茄（Lycopersicon esculentum）等农作物、蔬菜品种72个。航天育种小麦6 185.7kg／hm2，比普通小麦4 698kg／hm2提高31%，航天育种大豆3 000 kg／hm2，比普通大豆1 737kg／hm2提高72%。国外主要集中在美国和俄罗斯，美国重点研究植物对引力的感受和反应，最终开发适合太空旅游的植物；俄罗斯主要集中在太空环境对植物或细胞组织生长、发育及衰落过程中的影响。航天育种我国走在世界前列，我国的牧草航天诱变育种尚处于初始阶段，主要集中于苜蓿品种的选育［13－16］。

采用高端的空间技术与常规农业育种技术相结合，是一种具有创新型的育种研究。针对我国干旱面积较大、苜蓿品种单一、老品种产量低、质量差、病虫害发生严重的现状，筛选或培育适应性强、耐旱性强、抗寒、耐湿，而又高产的牧草品种，实为当务之急［2］。中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所于2009年与甘肃省航天育种工程技术中心（天水神舟绿鹏农业科技有限公司）合作研究搭载于神舟三号飞船的4个紫花苜蓿品种：德宝、德福、三得利、阿尔冈金；目前，已建立2个紫花苜蓿航天搭载原始材料筛选圃（甘肃省航天育种工程技术中心和兰州畜牧与兽药研究所）和2个实验区（兰州畜牧与兽药研究所大洼山试验站和天水农科所实验基地）。本研究以兰州试验点2010年种植的航天诱变原始材料筛选圃为研究对象，主要从生长速度、多叶突变、叶面积3个农艺指标开展研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

4个航天搭载苜蓿材料：德宝（M.sativacv.Derby），以下简写为‘DB’；德福（M.sativacv.Deful），以下简写为‘DF’；三得利（M.sativacv.Sanditi），以下简写为‘S’；阿尔冈金（M.sativacv.Algonguin），以下简写为‘A’，由甘肃省航天育种工程技术中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 2002年3月将4个精选紫花苜蓿种子每个分为2份，1份按要求密封搭载于神舟三号飞船，搭载时间为2002年3月25日－2002年4月1日，飞行高度为198～338km，倾角42.4°，绕地球108圈［3］；另1份作为地面对照（CK），称为未搭载原种，地面低温储存。

1.2.2 材料种植 2010年4个搭载原始材料与地面对照未搭载原种，同时种植于中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所兰州试验地，形成兰州航天诱变原始材料筛选圃（以下简称原始筛选圃），4个品种分4个小区种植，采用穴播，株距、行距各1m，单株做田间标记。

1.2.3 田间观察记载内容 a）生育期：按草品种审定技术规程执行，分为播种、出苗、分枝、孕蕾、开花、乳熟、成熟7个阶段。

b）株高测定：标记单株测定，测量从地面至植株的最高部位的绝对高度，于分枝期、孕蕾期、初花期、盛花期、结荚期测定。

c）茎叶比测定：在开花初期单株采样，取鲜草0.5kg样品，将茎和叶、花序按两部分分开，待风干后称其重量，求其百分数。

d）单株分枝数、叶面积及叶片数均在开花初期分别测定，叶面积测量单株第一孕蕾枝下的叶片。

2 结果与分析

2.1 成活率

德宝搭载当代（SP1）种植96株，成活81株，成活率84.4%，未搭载对照成活率97.0%。德福搭载当代（SP1）种植104株，成活97株，成活率93.3%，未搭载对照成活率98.0%。三得利搭载当代（SP1）种植96株，成活72株，成活率75.0%，未搭载对照成活率96.0%。阿尔冈金搭载当代（SP1）种植108株，成活91株，成活率84.3%，未搭载对照成活率98.0%。

兰州筛选圃，2010年栽培结果：不同品种经航天诱变后，成活率有差别，德福成活率最高93.3%，三得利成活率最低75.0%，表明航天诱变对植株死亡率的影响较大，植株死亡可能是由于基因变异导致生长发育过程中某关键物质缺失所致，在辐射、化学等各种诱变中普遍存在。

2.2 生育期观测记载

生育期按播种、出苗、分枝、孕蕾、开花、乳熟、成熟记载，兰州筛选圃2010年栽培结果：4个搭载品种兰州试验点于当年4月5日播种，由于当年兰州春季气温较低，各品种出苗相对较迟，都于4月下旬出苗；5月底、6月初开始分枝；7月初进入初花期，7月中旬进入盛花期；9月中、下、旬成熟（表1）。第2年4月中旬返青，5月底开始孕蕾；6月中下旬进入花期，7月底8月初成熟。

2.3 生长速度

2010年对初步选定的14株生长速度较快的单株分别在分枝期、孕蕾期、开花初期、开花盛期、结荚期测定株高，并计算日生长量，2011年继续跟踪观测，种植当年，刈割最佳时期初花期，株型好、株高高于对照10%以上的单株有10株，最高单株（DF－30）高于对照26.6%，DF－23、A－64均高于对照20%以上（表2）；日生长量高于对照10%以上的单株有3株，最高单株（DF－30）高于对照17.93%，其次单株DF－23和A－64分别高于对照16.84%和11.41%。2011年，刈割最佳时期初花期，株型好、株高高于对照20%以上的单株有4株，最高单株（DF－30）高于对照25%，DF－23、DF－57、DF－64均高于对照20%以上；日生长量高于对照10%以上的单株有12株，最高单株（A－77）高于对照52.48%和40%的单株有2株，高于30%的单株有2株。连续2年跟踪观测14个单株生长规律基本一致，个别存在差异，种植当年可能属于辐照生理损伤，一般以第2年观测为准，这14个单株可作为诱变速生集团，为培育速生高产苜蓿新品种提供亲本材料，其中 DF－23、DF－30、DF－57、DF－64、A－64单株株型紧凑、生长速度、日生长量明显高于对照，且相对稳定。

表1 生育期观察表Table 1 Generational cycle observation 月－日 Month－day

2.4 多叶苜蓿

紫花苜蓿为三初复叶，常规栽培中出现多叶的机率很少，经航天诱变之后出现各种多叶情况，发现以5，7叶居多，4，6叶的变异相对较少，极个别变异为8，9，10，11，12叶，航天诱变之后苜蓿叶片以奇数变异为主。

2.4.1 多叶苜蓿叶面积、分枝数及叶片数 2011年6月开花初期，在多叶突变原种田，对6株多叶突变株测定叶长、叶宽、分枝数、叶片数等指标，多叶单株的叶面积略高于对照，个别单株（S－50）显著高于对照；分枝数各单株之间差异较大，分枝数最多的单株（S－50）可达70枝，多于对照56枝；各多叶单株以三叶为标准计算，多叶单株使叶片增加率超过10%的有2株（S－30、S－39），增加率分别为11.00%和13.20%（表3）。

2.4.2 多叶单株茎叶比测定 6株多叶苜蓿，开花初期随机选择3株测定茎叶比，将茎和叶、花序按2部分分开，待风干后称其重量，求其百分数。结果表明，2010年3株多叶苜蓿单株茎叶总风干重平均值30.59g，比对照（21.8g）增加了40.3%，2011年单株生物量较对照提高20%～30%；茎叶比2010年0.93比对照（1.20）减小22.5%，2011年0.76比对照（1.18）减小35.59%（表4），可见多叶苜蓿显著增多了叶片数量，可以有效提高苜蓿的品质质量。

表2 速生单株不同生育期株高Table 2 Plant height in different generation

表3 多叶单株叶面积、分枝数及叶片数Table 3 The leaf area，leaf number and ramification number of multifoliator plant

表4 单株茎叶比测定Table 4 Ratio of stem to leaf

2.5 大叶单株

2011年开花初期测定叶面积，未搭载对照品种平均值叶长2.99cm，叶宽0.98cm，叶面积为2.11cm2；航天诱变后苜蓿最大值叶长5.2cm，叶宽3.0cm，叶面积最大为10.76cm2，比对照增大409.9%（约5倍）（表5）。诱变后叶面积增大率超过70%的有5株，增大率超过30%～70%的有6株，共计11株可作为大叶苜蓿集团，为大叶苜蓿新品种选育提供亲本材料。

表5 叶面积观测表Table 5 The table of leaf area

2.6 白花苜蓿单株

兰州原始筛选圃中发现1株花色为纯白，叶片狭小，叶片数多，抗旱性强的突变单株，目前已通过扦插、种子种植在隔离区建立了航天诱变白花苜蓿原种田。

2.7 抗病单株

天水原始筛选圃中发现7株高抗病虫害单株，主要虫害为蓟马和蚜虫，目前在实验室内开展抗病单株筛选，并通过扦插和种子繁殖在高发病区。

3 讨论

航天诱变是多因素综合作用，且存在未知的诱变因素，因此，对作物的诱变方向具有不确定性，第一，可以创造出符合人类需要的有益变异，试验数据表明变异率因品种而异，约占1%～3%，经过选择可以创造有益的新种质，培育新品种；第二，对植物不产生变异；第三，对植物产生不利的变异。一般认为诱变后第一代植株发生变异，个别属于生理损伤，有些可以稳定遗传给后代，有些仅局限于当代，不能遗传，再经过三或四代的种植，基因组变异能稳定地遗传给后代，获得表型和基因型变异均稳定的突变株系［16］。紫花苜蓿经航天诱变后，表现出较强的诱变效应，Xu等［4］发现，紫花苜蓿诱变SP1代材料叶片的总氨基酸含量显著增加，淀粉酶带减少。任卫波等［5］发现，诱变SP1代苜蓿幼苗根尖细胞分离指数、染色体畸变等方面表现出显著的诱变效应，同时发现诱变后苜蓿的株高、初次分枝数、单株生物量等农艺经济性状指标发生显著变化［6］。冯鹏等［7］研究发现，种子含水量对诱变效应具显著影响，以含水量13%～15%为最佳。王密［8］发现苜蓿搭载当代和二代种子的标准发芽率和盐胁迫发芽率均无显著变化，田间观测发现，搭载后的苜蓿单株株高、分枝数、单株生物量鲜重、干重均出现不同程度的增加，差异均达到显著水平（P＜0.05），此结论与田间观测结果基本一致。杜连莹［9］对“实践八号”搭载的8个苜蓿品种研究表明：SP1代根尖细胞的有丝分裂指数呈上升趋势；测定发现搭载后的8个品种叶片内POD活性均增强、可溶性蛋白含量均增高、叶片内SOD活性均降低。张月学等［6］研究发现，同一批航天诱变的苜蓿不同品种，在发芽率、单株分枝数等性状上存在差异，本研究发现诱变后株高变异：4个品种诱变后的平均株高总体上呈增加趋势，但不同品种增大幅度存在差异，初花期株高高于对照20%的单株有4株，全为德福，总体株高诱变效率：德福＞德宝＞阿尔冈金＞三得利，这与任卫波等［5］的研究规律基本相同。任卫波等［5］研究搭载于第18颗返回式卫星的3个紫花苜蓿品种：中苜一号、龙牧803、敖汉苜蓿，结果表明，卫星搭载的生物学效应因品种和时期而异，以株高正向变化为指标，3个品种的诱变效率有差异。此结果可能是由不同紫花苜蓿品种间诱变敏感性的差异引起［10－12］，本研究认为可能与品种自身的隐形基因诱变后被表达有关。不同品种叶片变异有所不同，多叶苜蓿以三得利最为显著，由三初复叶变异为4，5，6，7，8，9叶，其中5叶居多，4，6叶的变异少，有2株变异为7～9叶，对照未出现多叶情况，可见航天诱变之后苜蓿叶片以奇数变异为主，这与大田中多叶变化情况基本相符。大叶苜蓿以德福最为显著，筛选圃内诱变后叶面积增大率超过对照70%的有5株，德福占4株；以往研究中未报道苜蓿搭载后有出现多叶和大叶的变异，本研究认为：多叶突变体增多了叶片数量、大叶苜蓿增加了叶面积，都可以使茎叶比降低，叶量明显增大，有效提高了苜蓿的品质质量。不同品种表现出不同的变异类型，可能因为各品种自身存在某些特异基因型在大田栽培种中不容易表达，而在航天诱变后得到表达，这些变异材料的遗传稳定性能否稳定遗传，有必要下一步在分子标记和后续世代田间继续观察中进行确认。

4 小结

苜蓿航天诱变表现出较强的诱变效应，变异频率高、变异幅度大、有益变异多，变异类型基本符合苜蓿常见变异规律，但是集中了苜蓿多种有益变异类型于一起，节省了育种者搜集亲本材料的时间和精力，缩短了育种的年限。

苜蓿航天诱变最明显的变异是显著提高了生物量，是苜蓿育种最有益之处，由于搭载当代的某些性状可能是由生理损伤或基因位点变异引起，因此变异材料的遗传稳定性有必要下一步在分子标记和后续世代田间继续观察中进行确认。

不同品种经航天诱变表现出不同的突变类型，德福以生长速度较为显著、三得利以多叶变异较为显著、德宝以叶面积增大较为显著，可见航天诱变并非盲目、无规律变异，而与品种自身特性相关联。

［1］ 密士军，郝再彬.航天育种研究的新进展［J］.黑龙江农业科学，2002，（4）：31－33.

［2］ 杨红善，常根柱，周学辉，等.美国引进苜蓿品种半湿润区栽培试验［J］.草业学报，2010，19（1）：121－127.

［3］ 范润钧，邓波，陈本建，等.航天搭载紫花苜蓿连续后代变异株系选育［J］.山西农业科学，2010，38（5）：7－9.

［4］ Xu Y Y，Jia F，Wang B.Changes in isoenzymes and amino acids in forage and germination of the first post－flight germination of seeds of three legume species after space－flight［J］.Grass and Forage Sciences，1999，54：371－375.

［5］ 任卫波，徐柱，陈立波，等.紫花苜蓿种子微卫星搭载后其根尖细胞的生物学效应［J］.核农学报，2008，22（5）：566－568.

［6］ 张月学，刘杰琳，韩微波，等.空间环境对紫花苜蓿的生物学效应［J］.核农学报，2009，23（2）：266－269.

［7］ 冯鹏，刘荣堂，历为宏，等.紫花苜蓿种子含水量对微卫星搭载诱变效应的影响［J］.草地学报，2008，16（6）：605－608.

［8］ 王密.紫花苜蓿种子空间诱变变异效应的研究［D］.内蒙古：内蒙古农业大学，2010.

［9］ 杜连莹.实践八号搭载8个苜蓿品种生物学效应研究［D］.哈尔滨：哈尔滨师范大学，2010.

［10］ 任卫波，韩建国，张蕴薇，等.几种牧草种子空间诱变效应的研究［J］.草业科学，2006，23（3）：72－76.

［11］ 任卫波，韩建国，张蕴薇，等.航天育种研究进展及其在草上的应用前景［J］.中国草地学报，2006，28（5）：91－97.

［12］ 任卫波，王蜜，陈立波，等.卫星搭载对苜蓿种子PEG胁迫萌发及生长的影响［J］.草地学报，2008，16（4）：428－430.

［13］ 夏素银，王成章，詹发柏.苜蓿草粉饲粮添加纤维素酶对蛋鸡生产性能、蛋品质及养分利用率的影响［J］.草业学报，2011，20（5）：183－191.

［14］ 景艳霞，袁庆华.NaCl胁迫对苜蓿幼苗生长及不同器官中盐离子分布的影响［J］.草业学报，2011，20（2）：134－139.

［15］ 衣兰智，李长忠，刘洪庆，等.不同苜蓿品种在青岛地区的适应性［J］.草业学报，2011，20（2）：147－155.

［16］ 马学敏，张治安，邓波，等.不同含水量紫花苜蓿种子卫星搭载后植株叶片保护酶活性的研究［J］.草业科学，2011，28（5）：783－787.