影响呼出气冷凝液pH值、一氧化氮、过氧化氢测定因素的探讨

吕晓红，李 丹，袁海波，华树成

（吉林大学第一医院 呼吸内科，吉林 长春 130021）

影响呼出气冷凝液pH值、一氧化氮、过氧化氢测定因素的探讨

吕晓红，李 丹，袁海波，华树成＊

（吉林大学第一医院 呼吸内科，吉林 长春 130021）

目的 探讨呼出气冷凝液（EBC）收集方式，EBC保存时间与吸烟等对EBC内pH值、一氧化氮（NO）、过氧化氢（H2O2）测定结果的影响，从而确定EBC收集的条件，提高EBC内物质检测结果准确性。方法应用自行研制的EBC收集器对20名健康受试者进行EBC的收集。收集的受试者分别采用不同呼吸方式、不同冷却温度、不同通气管等进行样本收集。EBC的pH值测定应用pH仪，NO和H2O2测定分别采用化学分析法进行测定。结果pH值检测主要受到EBC采集时呼吸方式的影响，NO检测受到EBC采集时呼吸方式、EBC收集器通气管道，EBC保存时间的影响，H2O2检测受到EBC采集时呼吸方式、冷却温度、EBC收集器通气管道、EBC保存时间的影响。受试者自身生理条件以及吸烟等因素对于pH值、NO、H2O2检测没有明显影响。结论进行EBC内pH值、H2O2、NO检测时应充分考虑EBC收集方式以及EBC保存时间对检测结果的影响，从而提高检测的真实性。

呼出气冷凝液；pH值；一氧化氮；过氧化氢

（ChinJLabDiagn，2012，16：1833）

呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）检测是近年来新出现的检测呼吸道疾病炎症状态的无创检测手段，具有简便、易行、重复性好等优点，分析EBC内的物质可以评价肺部疾病的病理生理学变化情况，为监测肺部疾病的进展和治疗效果提供了新途径［1，2］。

pH值、一氧化氮（nitric oxide，NO），过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）是反映呼吸道炎症与氧化应激的重要分子，这些分子检测的准确性对于临床病情的判定尤为重要［3，4］。本研究拟在利用自行制备的EBC收集器进行EBC收集基础上，对EBC收集时呼吸方式、冷却温度、EBC收集器通气管道、EBC保存时间、受试者自身生理条件以及吸烟等因素对pH值、NO、H2O2检测的影响进行初步探讨，旨在确定EBC收集的最佳方案，提高检测的准确性。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象选取吉林大学第一医院护士、医生与健康志愿者共20人，均无任何疾病，男性7人，女性13人，年龄25～65岁，平均年龄为45岁，吸烟者10例，不吸烟者10例。肺功能检查结果：FEV1／预计值%为103.1% ±18.99%，潮气量为0.44±0.08L，每分通气量17.305±14.566L／min。所应用肺功能仪：购自美国森迪斯医学仪器有限公司，型号：622D。

1.2 实验分组分别检测不同的呼吸方式（鼻式吸气与口式吸气）、冷却温度、收集通气管（弯管与直管）、保存时间下EBC内pH值、H2O2、NO，分别评价这些因素对EBC物质检测的影响。

1.3 EBC收集方法应用自制EBC收集器［5］（已申请专利，申请号200810050485.X）进行EBC收集。方法如下：受试者休息15min，漱口，带或不带鼻夹，去枕、仰卧位（根据病人情况，不能平卧者取坐位）平静呼吸10-15min，收集过程中有唾液嘱患者咽下，如咳嗽嘱其暂停收集。收集完毕后测量EBC的量并分装在－80℃冰箱保存。每次收集后取样管用去离子水冲洗3遍烤干待用。阻唾液套管及其与取样管连接的硅胶管用去离子水冲洗3遍晾干待用。收集时间均选择上午10点。采集中随时观察有无胸闷、气短、意识改变及其他不良反应，并及时处理；采集时室温为19～21℃，湿度为48%～49%。

1.4 EBC的pH值、NO、H2O2的检测

1.4.1 将收集的EBC利用pH计进行检测。

1.4.2 EBC的NO的检测 应用经典的Griess化学分析法进行检测，采用碧云天生物技术公司的一氧化氮检测试剂盒，主要过程按试剂盒说明进行操作。

1.4.3 EBC的H2O2的检测 H2O2的检测应用化学分析法进行检测，采用碧云天生物技术公司的过氧化氢检测试剂盒，主要过程按试剂盒说明进行操作。

1.5 数据处理利用SPSS10.0统计软件进行两组之间的t检验和相关性分析。数据值用±S表示，P＜0.05为显著性差异。

2 实验结果

2.1 不同呼吸方式对EBC内pH值、H2O2、NO检测的影响在利用通气管为弯管，冷却温度为－15℃，收集时间为15min的收集条件下，分别采用鼻式吸气和口式吸气进行EBC收集并检测。结果表明：鼻式吸气与口式吸气收集EBC内的pH值、H2O2、NO均有明显差异（P＜0.05）（表1）。

2.2 不同冷却温度对EBC内pH值、H2O2、NO检测影响采用口吸、弯管、冷却温度分别为－15℃、－10℃、－5℃，收集EBC 10min并检测 结果表明：EBC内pH值、NO在不同冷却温度没有差异（P＞0.05）；H2O2随着温度升高检测浓度减少，有明显差异（P＜0.05）。（表1）

表1 不同收集条件下各影响因素对EBC的PH、H2O2、NO检测的影响

2.3 不同的收集通气管对pH值、H2O2、NO检测影响采用口吸、冷却温度为－15℃，收集时间为10 min，分别采用弯管和直管收集EBC并检测。结果表明：在直管与弯管收集EBC内的pH值无差异；直管与弯管收集EBC内的H2O2和NO水平存在显著性差异（表1）

2.4 EBC的不同保存时间对pH值、H2O2、NO检测影响采用口吸、弯管、冷却温度为－15℃，收集EBC 10min，分别-80℃保存24h、48h后检测。结果表明：pH值并没有随EBC保存的时间而变化（P＞0.05）；H2O2和NO检测浓度随EBC保存的时间延长有所下降，具有明显性差异（P＜0.05）。（见表1）

2.5 年龄、身高、体重等生理指标对EBC内PH值、H2O2、NO测定的影响采用口吸、弯管、冷却温度为－15℃，收集EBC 10min，检测并对结果进行相关性分析。结果表明：年龄、身高、体重等生理指标与EBC内pH值、H2O2、NO检测结果没有相关性（相关系数r很小，在0～0.286之间）。

2.6 吸烟对EBC pH值、H2O2、NO测定的影响对吸烟与未吸烟的受试者采用口吸 、弯管、冷却温度为－5℃，收集EBC 10min并的检测。结果表明：pH值在两者之间没有变化，H2O2、NO在吸烟者比未吸烟者高，但两者相比没有显著差异。（见表1）

3 讨论

EBC检测在呼吸系统疾病诊断与治疗方面的应用研究越来越得到重视，但EBC内物质的检测结果易受到多种因素的影响，如EBC收集方式（包括呼吸方式、冷却温度、收集器通气管）、EBC保存时间、受试者自身生理条件以及吸烟等，从而影响疾病判定的准确性与可行性。

本研究通过对上述因素进行逐一检测分析，结果显示呼吸方式对pH值、H2O2、NO测定有明显影响，考虑到鼻式吸气可能的污染，所以EBC的收集应采用用口吸气用口呼气方式。

在收集通气管的选择上，直管与弯管收集EBC的pH值无差异，但收集EBC的H2O2和NO水平存在显著性差异，所以在进行EBC收集时应采用阻唾液管（弯管），防止唾液的污染对检测物质的影响。

有研究表明EBC冷却温度对于一些物质的检测具有影响［6］。本研究结果表明：EBC内的pH值、NO不受温度的影响，但H2O2随着温度升高检测浓度减少，说明H2O2的检测受到EBC冷却温度的影响，所以在检测这类物质时应注意冷却温度。

EBC内一些物质很不稳定，所以长时间的保存可能对EBC检测有影响。本研究结果表明：ECG内pH值并没有随保存的时间而变化，而H2O2和NO检测浓度随EBC保存的时间有所下降。所以，对于H2O2、NO等不稳定的物质，应该尽早检测，不宜保存时间过长。

有研究表明［7］年龄对EBC内H2O2的检测有一定的影响，但本研究没有发现任何生理指标与pH值、H2O2、NO测定结果有相关性。本研究结果与文献报道并不相同，考虑原因有两方面，一是样本量较少，二是考虑EBC收集和测量的方法不同。总之，在进行疾病研究时，应尽量选择生理指标相近的样本作为对照，尽量减少由于生理指标对于检测带来的差异。

吸烟将会提高正常人与呼吸疾病患者EBC内某些物质浓度，如H2O2、8-异前列素、硝基酪氨酸、细胞因子等［8，9］。但本研究结果显示EGC内pH、H2O2、NO在吸烟者与未吸烟相比没有显著差异。与文献报道不同的原因可能为：（1）吸烟的方式对物质测定的影响，有研究表明急性吸烟与慢性吸烟对EBC物质检测的影响不同，本研究并没有注意这一点；（2）在吸烟患者测定EBC的H2O2、NO结果的变异系数较大，对比较结果有一定影响，所以需要进一步加大样本量进行研究。

［1］Hoffmeyer F，Raulf-Heimsoth M，Brüning T.Exhaled breath condensate and airway inflammation［J］.Curr Opin Allergy Clin Immunol，2009，9（1）：16.

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［5］吕晓红，彭丽萍，华树成.一种新型呼出气冷凝液收集器的设计与组装［J］.实验技术与管理，2010，27（8）：68.

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Study on the effects of pH value、nitric oxide、hydrogen peroxide in EBC

LVXiao-hong，LIDan，YUANHai-bo，etal.（DepartmentofRespiratoryDisease，TheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the effects of the method for exhaled breath condensate（EBC）collection，EBC preservation time and smoking on pH value，nitric oxide（NO），hydrogen peroxide（H2O2）in EBC，determine the appropriate conditions for collection of EBC，and improve the accuracy of test results for the material in EBC.MethodsEBC collection was completed on 20healthy subjects by EBC collector developed by our lab.The samples were collected by different breathing patterns，at different collection temperature，and by different snorkel，etc.PH value of EBC was determined by pH apparatus，the levels of NO and H2O2were determined by chemical analysis method.ResultspH value was mainly affected by breathing pattern when EBC was collected；The level of NO was affected by breathing pattern，EBC collector ventilation pipe and EBC preservation time；The level of H2O2was affected by breathing pattern，temperature when collected，EBC collector ventilation pipe and EBC preservation time.No significant effects of the physical conditions and smoking were found on the above parameters.ConclusionThe method for EBC collection and EBC preservation time should be taken into consideration to improve the accuracy of the results when pH value，the levels of H2O2and NO was detected in EBC.

exhaled breath condensate；pH value；nitric oxide；hydrogen peroxide

R446.19

A

1007－4287（2012）10－1833－03

吉林省科技厅基金资助课题（20060582）

＊通讯作者

吕晓红（1973-），女，吉林省长春市人，副主任医师，医学博士，主要从事呼吸系统感染性疾病的研究；华树成，教授，博士生导师，吉林大学第一医院副院长，主要从事呼吸系统疾病诊治。

2011－08－15）