三氧化二砷联合硼替佐米诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株凋亡及相关机制的研究

Aadil Yousif，牛 超，李 薇，蒿姗姗，徐效义，崔久嵬

（吉林大学第一医院 肿瘤中心，吉林 长春 130021）

三氧化二砷联合硼替佐米诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株凋亡及相关机制的研究

Aadil Yousif，牛 超，李 薇，蒿姗姗，徐效义，崔久嵬＊

（吉林大学第一医院 肿瘤中心，吉林 长春 130021）

目的 本研究旨在探讨三氧化二砷与硼替佐米联合应用对多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）细胞株RPMI8226细胞凋亡的影响及其相关机制。方法CCK-8法检测三氧化二砷与硼替佐米联合应用对RPMI8226细胞增殖的抑制作用；采用流式细胞术检测两种药物诱导RPMI8226细胞凋亡情况及各药物组处理前后的细胞表面死亡受体4（death receptor 4，DR4）和死亡受体5（death receptor 5，DR5）表达的变化；Western blot检测各药物组Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP蛋白表达水平的变化。结果三氧化二砷与硼替佐米联合组对RPMI8226细胞生长抑制明显高于三氧化二砷单药组，细胞凋亡率均较三氧化二砷单药组明显增多，细胞表面DR4和DR5表达明显增高。与三氧化二砷或硼替佐咪单药组相比较，联合用药组RPMI8226细胞Bcl-2表达下调明显，而caspase-3，caspase-8和caspase-9表达上调明显。结论硼替佐米可以增加RPMI8226细胞对三氧化二砷诱导凋亡的敏感性，这可能与Bcl-2的表达下调及caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP蛋白的表达上调有关。

多发性骨髓瘤；硼替佐米；三氧化二砷；协同作用

（ChinJLabDiagn，2012，16：1801）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是最为常见的血液系统恶性肿瘤之一。近年来，一些新型的分子靶向药物，例如硼替佐米（bortezomib，BZ），明显提高了MM的缓解率，但其治疗仍存在复发和耐药的问题。虽然三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）为复发难治多发性骨髓瘤的提供了一种新的治疗手段，但目前临床试验显示，单用ATO仍有55%-80%患 者治疗无效［1］。本 研 究 基 于 BZ 和ATO具有不同的作用机制，选用MM细胞株RPMI8226细胞为研究对象。通过研究BZ与ATO联合作用于RPMI8226细胞的效果，探讨BZ是否能够增强RPMI8226细胞对ATO凋亡的敏感性，并对其机制进行探讨，为临床上治疗多发性骨髓瘤提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株购于美国ATCC；RPMI-1640、胎牛血清和PBS（Gibco公司）；硼替佐米（西安杨森公司）；三氧化二砷即亚砷酸氯化钠注射液（哈尔滨伊达药业公司）；6孔及96孔板培养板（Coring公司）；CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（武汉博士德）；Annexin V-FITC／PI细胞凋亡双染试剂盒（Bender公司）；Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP 单 抗、β-actin、DR4、DR5鼠抗人一抗多克隆抗体（Santa Cruz公司）；兔抗鼠二抗多克隆抗体（中杉金桥）；Western blot试剂盒（KPL公司）；FACScan型流式细胞仪（BD公司）；酶标仪（BIO-TEK公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株悬浮培养于含10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养液（内含2mmol／L谷氨酰胺）中，置于5%CO2饱和湿度的37℃培养箱培养。每48h传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 CCK-8法检测BZ联合ATO后细胞生长情况 收集对数生长期的RPMI8226细胞，调整细胞悬液浓度为1×106个／ml，接种于96孔板，100μl／孔。结合参考文献及预实验结果，BZ和ATO分别选取终浓度为20nmol／L及2μmol／L、5μmol／L。实验共设4组为：单药BZ（20nmol／L）处理组；单药ATO（0、2μmol／L 和 5μmol／L）处 理 组；BZ（20 nmol／L）联合 ATO（2μmol／L、5μmol／L）处理组；对照组（加同体积PBS）。于培养箱内培养48h后，每孔加入10μl CCK-8，5%CO2饱和湿度的37℃培养箱继续培养4h后，利用酶联免疫检测仪测量各孔在490nm下的吸光度（OD）。每组实验重复3次，根据金（正均）式公式来判定两种药物之间的相互作用。

Q＝E（a＋b）／（Ea＋Eb-Ea×Eb），式中Ea为ATO单药组的细胞抑制率，Eb为BZ单药组的细胞抑制率，E（a＋b）为联合用药组的细胞抑制率。当Q＜0.85时，两种药物为拮抗作用；当0.85≤Q＜1.15时，两种药物为单纯相加，当1.15≤Q时，两种药物为协同作用。

1.2.3 流式细胞仪 Annexin V-FITC／PI染色法检测细胞周期及凋亡情况 收集对数生长期的RPMI8226细胞，调整细胞密度为1×106个／ml，接种于6孔板，3ml／孔。实验分为ATO单药组（终浓度为5.0μmol／L）、BZ单药组（终浓度为20nmol／L）、两药联合组以及对照组（加同体积的PBS），培养48h后收集各组细胞。按细胞凋亡检测试剂盒说明书以Annexin V-FITC及PI标记细胞，于1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率，每组实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测两种药物联合后细胞表面DR4和DR5的表达情况 收集对数生长期的RPMI8226细胞，调整细胞悬液浓度为1×106个／ml，分为ATO单药组（终浓度为5.0μmol／L）、BZ单药组（终浓度为20nmol／L）、两药联合组以及对照组（加入同体积PBS），培养48h后收集各组细胞。加入鼠抗人DR4和DR5单克隆抗体工作液各100 μl，充分混匀后，4℃孵育30min。PBS洗涤3次，加入FITC标记的山羊抗小鼠的二抗，混匀后，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测，每组实验重复3次。

1.2.5 Western blot 检 测 药 物 作 用 后 Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9及 PARP 蛋白 水 平检测 收集各组药物作用后的RPMI8226细胞，加入预冷的PBS洗涤2遍，以1×107个／ml加入细胞裂解液（50mmol／L pH 8.0Tris-HCl，150mmol／L NaCl，1%Triton X-100，100μg／ml PMSF）置冰上30min后，13 000rpm，4℃离心20min，取上清，Bradford法测定蛋白浓度。蛋白样品行12-15%的SDS-PAGE后，转移至PVDF膜。含5%脱脂牛奶的 TBST封闭30min，分别用Bcl-2单抗、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及 PARP 抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10min。二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10min，然后显影曝光。以β-actin为内参照，统计数据以供分析。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS17.0软件，组间比较用方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BZ联合ATO作用后对细胞增殖的影响

经CCK-8检测两种药物单独应用及联合应用对RPMI8226细胞增殖能力的影响。结果发现，随着ATO药物浓度的增加，其对RPMI8226细胞增殖的抑制作用增强；20nmol／L的BZ分别联合2 μmol／L和5μmol／L的ATO对RPMI8226细胞作用后，计算Q值分别为1.30和1.27，说明BZ联合ATO作用于RPMI8226细胞，具有协同抑制作用（如图1）。

2.2 BZ与ATO联合对RPMI8226细胞凋亡的影响

分别对ATO单药组、BZ单药组、两药联合组及对照组的细胞，按细胞凋亡检测试剂盒说明书进行Annexin V和PI染色后利用流式细胞术检测进行细胞凋亡情况检测。如图2所示：BZ单药组、ATO单药组及两药联合组的细胞凋亡率分别为14.8%、16.3%及36.5%，与对照组（3.2%）相比，P＜0.01，有统计学意义。

2.3 两药联合对RPMI8226细胞表面DR4和DR5表达的影响

RPMI8226细胞经单药ATO、BZ以及两药联合作用后，经流式细胞仪检测对细胞表面DR4和DR5的表达的变化。如图3所示：单药组作用后，细胞表面DR4和DR5的表达均具有一定程度的升高，且两药联合组升高的更为明显，与对照组相比，P＜0.01，有统计学意义。

图1 ATO单独用药及联合用药对RPMI8226细胞的生长抑制曲线

图2 单独用药及联合用药对RPMI8226细胞的凋亡影响

图3 单独用药及联合用药对RPMI8226细胞DR4和DR5表达的影响

2.4 BZ 联 合 ATO 对 Bcl-2，caspase-3，caspase-8，caspase-9及PARP蛋白表达的影响

为了进一步研究BZ联合ATO对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖抑制作用的机制，我们检测了细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的水平及诱导细胞凋亡的caspase-3，caspase-8，caspase-9及 PARP蛋白表达水平。结果提示，单独使用ATO或者单独使用BZ均 能 够 降 低 Bcl-2 的 表 达，并 使 caspase-3、caspase-8、caspase-9和 PARP 的表达增加，两药联合后可使上述作用增强（如图4）。

图4 单独用药及联合用药对Bcl-2，Caspase-3、8、9及PARP蛋白表达的影响

3 讨论

迄今为止，多发性骨髓瘤仍是一种不可治愈性疾病，新的有效的治疗方案是提高MM缓解率和延长生存期的关键。本研究结果显示BZ具有增强ATO对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞生长抑制生长和促进凋亡的作用。

诱导细胞凋亡主要通过内源性途径和外源性途径两种，其中外源性（或死亡受体）途径包括肿瘤坏死因子（TNF）家族受体和配体，激活caspase-8；内源性途径包括线粒体成分释放调控的激活，活化caspase-9，两条徐径均通过激活caspase-3而诱导凋亡［2］。本实验中 BZ联合 ATO 对细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表达较单用药组均有明显增强，提示二者联合应用是通过此作用来实现的。Caspase家族与Bcl-2被认为是与细胞凋亡发生与调节密切相关［3］。本研究也检测了Bcl-2的表达，显示BZ与ATO具有协同降低bcl-2表达，提示其可能通过降低此抗凋亡蛋白的表达，而促进内源性凋亡途径的激活。

为进一步明确二者联合应用是如何增加caspase的表达，本实验对其上游调控因子进行了研究。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是近年发现的TNF家族成员，其受体属于TNF受体超家族［4，5］。多发性骨髓瘤细胞表达DR4和DR5并通过与配体TRAIL结合有效地激活外源性凋亡途径，导致Caspase-8激 活，诱 导 凋 亡［6，7］。 本 研 究 结 果 显 示，ATO、BZ均可诱导MM细胞凋亡受体分子DR4、DR5表达上调，且二者具有协同作用。DR4、DR5表达与诱导MM细胞凋亡的信号转导途径密切相关，DR4和DR5表达上调可增加TRAIL与受体结合的概率，间接提高了TRAIL的活性，促进细胞凋亡，提示BZ与ATO协同促凋亡作用部分是由此通路介导的。

综上所述，BZ联合ATO具有协同激活内源性和外源性凋亡通路，抑制多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖和促进其凋亡，两者合用有可能为多发性骨髓瘤临床治疗开辟一条新途径。

［1］Christoph Rolig，Thomas illmer.The efficacy of arsenic trioxide for the treatment of relapsed and refractory multiple myeloma：A systematic review［J］.Cancer Treatment Reviews，2009，35（5）：425.

［2］Twomey C，McCarthy JV..Pathways of apoptosis and importance in developement［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2005，9（2）：345.

［3］Cory S，Adams JM.The Bcl2family：regulators of the cellular life-or-death switch［J］.Nature，2002，2（9）：647.

［4］Sarah Shirley，Alexandre Morizot，Olivier Micheau.Regulating TRAIL receptor-induced cell death at the membrane：a deadly discussion［J］.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2011，6（3）：311.

［5］Szegezdi E，Cahill S，Meyer M，et al.TRAIL sensitisation by arsenic trioxide is caspase-8dependent and involves modulation of death receptor components and Akt［J］.British Journal of Cancer，2006，94（3）：398.

［6］Mahalingam D，Szegezdi E，Keane M，et al.TRAIL receptor signalling and modulation：Are we on the right TRAIL［J］.Cancer Treatment Reviews，2009，35（3）：280.

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Apoptosis of RPMI8226cell induced by arsenic trioxide combined with bortezomib and its mechanism

AadilYousif，NIUChao，LIWei，etal.（CancerCenteroftheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the effects of arsenic trioxide and bortezomib on apoptosis of human multiple myeloma RPMI8226cells and its mechanism.MethodsCell proliferation was detected by CCK-8method to study the role of arsenic trioxide and bortezomib in RPMI 8226cells.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.The expression of cell surface death receptor 4（DR4）and death receptor 5（DR5）was also measured by flow cytometry.Western blot was applied to detecte the expression level of Bcl-2，caspase-3，caspase-8 ，caspase-9and PARP protein.ResultsThe group of arsenic trioxide combind with bortezomib showed more inhibitory effect on RPMI 8226cells than that of arsenic trioxide group.The apoptosis rate was significantly increased than arsenic trioxide group.The expression of DR4and DR5on the cell surface was significantly increased.Compared with arsenic trioxide group，the expression of Bcl-2was significantly decreased in the combined treatment group，while the expression of caspase-3，caspase-8，caspase-9and PARP were significantly increased.ConclusionIt is concluded that bortezomib can enhance sensitivity of RPMI8226to apoptosis by arsenic trioxide，which may be associated with decreasing the expression of Bcl-2and increasing the expression of caspase-3，caspase-8，caspase-9and PARP protein.

multiple myeloma；bortezomib；arsenic trioxide；apoptosis

R733.3

A

1007－4287（2012）10－1801－04

国家青年自然基金（30901702），吉林省中医药局项目（2010-pt057），吉林省中青年领军人才创新团队项目（20111807），吉林大学杰出青年基金（201005001）

＊通讯作者

Aadil Yousif（1974-），男，在读博士。

2012－05－24）