产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类药物耐药基因研究

张淑青

［开滦（集团）有限责任公司医院，河北 唐山063000］

产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类药物耐药基因研究

张淑青

［开滦（集团）有限责任公司医院，河北 唐山063000］

目的 了解本院产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌对氨基糖苷类的耐药情况及耐药基因的表达状况。方法用聚合酶链反应（PCR）法检测aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-I、ant（2′′）-I、ant（3′′）-I、aac（3）-I等5种氨基糖苷类修饰酶（AMEs）基因。结果在临床分离的75株大肠埃希菌中共检出产ESBLs菌47株（62.67%）；产ESBLs菌携带AMEs基因检出情况，阳性率从高到低为：aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-I、ant（2′′）-I、ant（3′′）-I、aac（3）-I。产 ESBLs菌耐药情况从高到低依次为：链霉素、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星。结论大肠埃希菌产ESBLs率显著升高，耐药性增加；有些菌株同时携带两种或两种以上AMEs基因；ESBLs的产生可使大肠埃希菌对氨基糖苷类抗菌药物（AGs）的耐药情况加重。

大肠埃希菌；耐药性；氨基糖苷类修饰酶

（ChinJLabDiagn，2012，16：0299）

超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是一类由细菌质粒介导的β-内酰胺酶，能水解甲氧亚氨基β-内酰胺类抗生素，如青霉素类、头孢菌素及单环抗生素，其活性能被β-内酰胺酶抑制剂抑制。近年来，大肠埃希菌已成为医院感染的重要病原菌，随着抗生素的大量应用，大肠埃希菌产ESBLs菌株逐年增多，ESBLs在菌株间转移和传播更增强了细菌的耐药性，这一现象在临床已成为突出问题。为了解我院产ESBLs大肠埃希菌AMEs基因存在状况，我们对临床分离所得的75株大肠埃希菌产ESBLs情况进行药敏试验并检测了aac（3）－I、aac（3）－Ⅱ、aac（6′）－I ad、aac（6′）－I d、aac（6′）－Ⅱ、ant（2′′）－I、ant（3′′）－I 7种氨基糖苷类修饰酶基因现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源75株菌株来源于2007年l月至2009年1月我院临床标本分离所得（不含同一病例相同部位重复分离株），标本的采集、送检、实验室接收标本后的处理，按《全国临床检验操作规程》，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603（购自卫生部临床检验中心）。

1.2 仪器与试剂使用法国梅里埃的VITEK-2compact自动化微生物鉴定系统进行菌种鉴定；德国Biometra公司PCR仪；药敏纸片为英国Oxoid公司产品。

1.3 ESBLs验证实验使用双纸片协同测试法［1］，将含有头孢噻肟，头孢他啶，头孢噻肟／克拉维酸及头孢他啶／克拉维酸四纸片帖在涂有待测菌的琼脂培养基上孵育。当加上克拉维酸的纸片比没加的抑菌环直径差值≥5mm以上者，即判断为ESBLs菌株。

1.4 药物敏感试验采用Kirby-Bauer纸片扩散法，测定47株大肠埃希菌对5种AGs的敏感性，药敏结果均按照NCCLS最新标准判定。

1.5 基因检测均采用PCR法，根据氨基糖苷乙酰转移酶（AAC）靶基因设计引物，引物序列和目的产物长度见表1［2］。PCR 反应体系（25μl）：2×Taq PCR MasterMix 12.5μl（含 有：0.1U／μl Taq Ploymerase，500mmol／μl Dntp，20mmol／μl Tris-Cl，100mmol／μl KCL，3mmol／μl MgCl2），上下游引物（10mmol／L）各1μl，DNA 模版5μl，ddH2O 5.5μl。PCR扩增热循环参数为：95℃预变性3 min，然后95℃30s，55℃60S，72℃60S，循环30周期，最后72℃延长10min。产物经2%琼脂凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果，出现与阳性对照分子相等的条带判为阳性。

表1 氨基糖苷类修饰酶基因PCR引物序列

2 结果

2.1 大肠埃希菌产ESBLs验证结果临床分离的75株大肠埃希菌经表型验证，共检出产ESBLs菌株47株，阳性检出率为62.67%。

2.2 药敏结果47株产ESBLs大肠埃希菌对5种氨基糖苷类抗生素－庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素、链酶素的耐药情况分别为80.85%、10.64%、19.15%、51.06%、82.98%。与非产 ESBLs菌株相比，除阿米卡星和奈替米星外耐药性具有显著性差异（P＜0.05），详情见表2。

2.3 基因检测结果

47株大肠埃希菌中检出氨基糖苷类修饰酶基因37株（78.72%）。产ESBLs大肠埃希菌中各氨基糖苷类修饰酶阳性检出率：aac（3）-Ⅱ为51.06%、aac（6′）-I为 38.30%、ant（2″）-I为 25.53%、ant（3″）-I为10.64%、aac（3）-I为4.26%，与非产 ESBLs菌株比较，除aac（3）-I和ant（3″）-I外，其余基因阳性检出率差异有统计学意义（P＜0.05）。37株携带氨基糖苷类修饰酶基因的菌种中，有17株（36.17%）同时携带2个基因［以aac（3）-Ⅱ＋aac（6′）-I为主］；且产ESBLs菌株两基因携带率明显高于非产ESBLs菌株（P＜0.05），详情见表3。

表2 产ESBIs菌株对AGs耐药情况比较［n（%）］

表3 产ESBLs菌株与非产ESBI S菌株修饰酶基因阳性率比较［n（%）］

3 讨论

大肠埃希菌是临床各种细菌感染的常见病原菌。目前大肠埃希菌产ESBLs引起的耐药问题在临床显得十分突出，ESBLs通常由质粒所介导。本研究观察显示，75株大肠埃希菌ESBLs检出率为62.67%，表明大肠埃希菌产ESBLs在该地区流行严重。氨基糖苷类抗菌药（AGs）抗菌谱广、疗效卓越，在临床得到广泛应用，但氨基糖苷类药物耐药问题随之突出。在本研究中，从临床分离的47株产ESBI S大肠埃希菌对链霉素和庆大酶素的耐药率最高，达到82.98%和80.85%；其次妥布霉素51.06%，奈替米星19.15%，阿米卡星的耐药率较低，仅为10.64%。这可能与阿米卡星、奈替米星经过结构改造、对修饰酶具有一定稳定性有关，所以耐药率远低于庆大霉素和链霉素。大肠埃希菌对氨基糖苷类抗菌药的耐药机制主要有以下四个方面：①药物作用靶位的改变；②细胞壁通透性改变或细胞内转运异常；③氨基糖苷类修饰酶的产生；④16S rRNA甲基化酶的产生。

氨基糖苷类修饰酶（Aminoglycoside modifying cnzymcs，AMEs）能作用于氨基糖苷类抗生素特定的氨基或羟基，使抗生素发生钝化，降低或丧失对靶位16sRNA的亲和力，使细菌在抗生素存在的情况下具有一定存活能力的酶［3］。按功能可分成乙酰转移酶（AAC）、磷酸转移酶（AHP）、核苷转移酶（ANT）三类［4］。此类基因通过整合子，转座子、质粒等可移动性遗传元件，使其在同种或不同种细菌之间传播，所表现出来的自我保护机制与临床耐药机制相同。PCR技术的广泛应用，使对AMEs基因的检测变得及其容易。本研究采用PCR对氨基糖苷类修饰酶基因进行了分析，结果显示aac（3）-Ⅱ为51.06%，检 出 率 最 高；其 次 为 aac（6′）-I 为38.30%；最低的为aac（6′）-Ⅱ，检出率为0，且有17株（36.17%）同时携带2个基因。该结果说明从我院分离所得的大肠埃希菌产ESBLs对氨基糖苷类药物具有相当高的耐药性。

［1］Muriel G，Jean Winoc D，Nelly B，et al.Nationwide study of the prevalence，characterristics and molecular epidemiology of extendd-spectrum-β-lactamase-producing enter obacteriaceae on france［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（2）：786.

［2］吴 蓉，张 隆，戴俊华，等.产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药表型与修饰酶基因研究［J］.现代检验医学杂志，2010，25（3）：31.

［3］吴 蓉，张 隆，戴俊华，等.产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药表型与修饰基因研究［J］.现代检验医学杂志，2010，25（3）：31.

［4］游春芳，黄永茂，张馨琢，等.产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性探讨［J］.中华实验和临床感染病杂志，2010，4（3）：14.

Study of aminoglycosides resistance of extended spectrumβ-lactamases-producing strains of Escherichia.coli

.ZHANG Shu-qing.［HospitalAffiliatedtoKailuan（Group）LimitedLiabilityCompanyinTangshanCity，Tangshan063000，China］

ObjectiveTo study molecular epidemiology of the resistance to aminoglycosides（AGs）in Escherichia coli which produce extended spectrumβ-lactamases（ESBLs）.MethodsSix kinds of AMEs of 75strains E.coli.were detected by PCR.ResultsIn 75strains of E.coli.，47（62.67%）ESBLs-producing strains were comfirmed.The Positive rate of Five kinds of AMEs were aac（3）-Ⅱ，aac（6′）-I，ant（2′′）-I，ant（3′′）-I，aac（3）-I，from high to low.Resistance to aminoglycosides were streptomycin，gentamicin，tobramycin，netilmicin，amikacin，，from high to low.ConclusionE.coli.resistance to AGs became more serious because of ESBLs producing.Some strains had two or more than two kinds of AMEs gene.

Escherichia coli；drug resistance；AMEs

R378.2＋1

A

1007－4287（2012）02－0299－03

张淑青（1975-），女，本科学历，唐山市开滦（集团）有限责任公司医院主管技师，主要研究方向：细菌的耐药性。

2011－03－10）