rhKD／APP对肾缺血再灌注损伤大鼠自由基-抗自由基平衡以及凋亡中的保护作用

王 雪，张馨木，崔常雷，韩树海＊

（1.吉林大学第一医院 麻醉科，吉林 长春 130021；2.吉林大学药学院）

rhKD／APP对肾缺血再灌注损伤大鼠自由基-抗自由基平衡以及凋亡中的保护作用

王 雪1，张馨木2，崔常雷1，韩树海1＊

（1.吉林大学第一医院 麻醉科，吉林 长春 130021；2.吉林大学药学院）

＊通讯作者

重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂（rhKD／APP）是通过基因工程方法获得的具有广谱丝氨酸蛋白酶抑制活性的新型蛋白酶抑制剂，吉林大学药学院用毕赤酵母构建了rhKD／APP表达体系，并通过扩增和纯化手段获得了高纯度的具有天然结构和活性的表达体系rhKD／APP［1］，为深入研究其器官保护机理及临床应用奠定了基础。我研究小组已经报导了rhKD／APP对肾缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用［2］，本试验通过观察rhKD／APP对肾缺血再灌注损伤大鼠MDA、NO含量及SOD、GSH-PX活性以及对凋亡指数的影响，据此从自由基清除以及抗凋亡角度阐明rhKD／APP的器官保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物Wistar大鼠，雄性，250g－300g，购自吉林大学实验动物部。

1.2 材料与主要试剂rhKD／APP由吉林大学再生医学科学研究所生化室通过基因工程方法制备；依那普利（1.25mg／支），江苏省常州制药厂有限公司。

1.3 主要仪器TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机，长沙湘雅医疗器械厂；SYNCHRON CX3型生化分析仪，美国BECKMAN公司；电子分析天平AE100，Mettler-Toledo公司；HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统，日本；X-650型扫描电子显微镜，日本。

1.4 动物分组与处理取Wistar大鼠60只，随机分为6组，每组10只。第1组为伪手术组。第2组为肾I／R模型组（模型组）：行大鼠双肾肾蒂夹闭，暂时阻断手术，制备肾脏缺血再灌注模型［3］。第3、4、5组分别为rhKD／APP小、中、大剂量组：肾I／R＋分别尾静脉注射rhKD／APP 1、2、4万 KIU·kg－1。第6组为依那普利组（对照组）：肾I／R＋尾静脉注射依那普利0.134mg·kg－1。给药途径：第1－2组大鼠于造模前24h，模型建立后即刻，模型建立后24h尾静脉注射生理盐水，第3－5组大鼠于上述各时间点经尾静脉注射各个剂量的rhKD／APP，第6组（对照组）大鼠于上述各时间点经尾静脉注射依那普利。

1.5 检测指标及方法造模24h给药后，从腹主动脉抽取3－4ml血液，静置待血清析出后，以3 000r／min，离心10min，取上清液以美国BECKMAN—SYNCHRON CX3型全自动生化分析仪测定MDA、NO含量及SOD、GSH-PX活性。另取肾脏组织多聚甲醛液中固定，制备石蜡块。TUNEL法测定细胞凋亡指数。计算方法为：凋亡指数＝阳性细胞数／视野所有细胞数。

1.6 统计学处理采用SPSS软件包进行数据处理和统计分析，实验结果以x¯±s表示，计量指标两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 各实验组大鼠在肾缺血45min，再灌注48h后NO、MDA、SOD、GSH-PX活性见表1，与1组相比较，2组血清 NO、MDA含量显著升高（P＜0.01），血清SOD、GSH-PX活性较显著降低（P＜0.01），而4，5，6组大鼠血清 NO、MDA含量显著降低（P＜0.01或P＜0.05），SOD、GSH-PX活性显著升高（P＜0.01或P＜0.05）；3组对血清 NO、MDA、SOD、GSH-PX含量影响无显著性差异（P＞0.05）。5组对肾缺血再灌注损伤后大鼠血清NO、MDA、SOD、GSH-PX含量的的影响优于6组；4组对肾缺血再灌注后大鼠血清 NO、MDA、SOD、GSH-PX含量的影响与6组相近。

2.2 镜下组织学检查可见，假手术组大鼠肾小管上皮细胞疏散且界限较为不清，核着色浅蓝，仅见少量TUNEL弱阳性反应细胞。而模型组却可见大量TUNEL阳性反应细胞即凋亡细胞，胞体缩小，形状不规则，胞核固缩浓染，呈深棕色，凋亡指数显著高于假手术组（P＜0.01）。对照组有中等量TUNEL阳性细胞表达。rhKD／APP（小、中、大剂量）组TUNEL阳性反应细胞均明显减少，着色较浅，rh-KD／APP各剂量组凋亡指数，与模型组相比均显著减少（P＜0.05），与对照组表现相近（见表2）。

表1 rhKD／APP对肾缺血再灌注损伤大鼠血清NO、MDA、SOD、GSH-PX的影响（±s，n＝10）

表1 rhKD／APP对肾缺血再灌注损伤大鼠血清NO、MDA、SOD、GSH-PX的影响（±s，n＝10）

与模型组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 NO（μmol／L） MDA（nmol／L） SOD（U／ml） GSH-PX（U／L）假手术组 35.63±8.45＊＊ 3.18±0.31＊＊ 14.57±0.32＊＊ 1105.76±194.48＊＊模型组 50.19±9.90 4.52±0.94 8.68±4.47 634.76±114.90小剂量组 47.65±7.40 4.38±0.69 12.0±3.36＊ 676.92±205.89中剂量组 40.80±8.87＊ 3.57±0.95＊ 12.58±2.38＊ 767.69±103.24＊大剂量组 37.78±12.21＊＊ 3.31±0.5＊＊ 13.32±2.43＊＊ 831.22±145.41＊＊对照组 42.61±7.36＊ 3.51±0.82＊ 11.97±2.0＊ 750.16±100.63＊

表2 rhKD／APP对大鼠肾缺血再灌注细胞凋亡的影响

3 讨论

近年来大量研究证实，在导致肾缺血再灌注损伤的各种因素中，自由基连锁反应在其中扮演着重要的作用［4－7］。它可通过各种作用，如降低膜流动性、抑制酶的活性、破坏蛋白质等，进一步引起线粒体、内质网功能障碍和细胞管架系统紊乱。除此之外，毛细血管内皮细胞亦会受到过量自由基的攻击。可见，由于自由基的作用，可使肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞成片变性、坏死，引起肾小球滤过率下降从而发生肾功能衰竭。

随着近来研究的不断深入，人们逐渐意识到肾组织细胞也以凋亡的方式参与了肾缺血再灌注损伤的过程。研究发现：肾缺血再灌注时，细胞凋亡主要表现为皮髓交界处的肾小管发生凋亡，以再灌注12 h凋亡水平最高，可持续至少72h。凋亡的上皮细胞随着肾小管上皮的再生而进入管腔排出，吞噬细胞在此过程中未发挥作用［8］。目前，对于肾缺血再灌注后细胞凋亡的机制尚无明确报道，但可以确定肾缺血再灌注后肾小管上皮细胞死亡的重要原因之一为肾小管上皮细胞的主动凋亡。其调节受到钙超载、氧自由基、线粒体等许多内外因素的调节，且与凋亡基因的表达密切相关，体外给予丝氨酸蛋白酶抑制剂rhKD／APP，可能通过抑制丝氨酸蛋白酶活性，从而拮抗依赖丝氨酸蛋白酶的几个生理病理过程，包括丝氨酸蛋白酶依赖的NF-kB炎症转录途径，丝氨酸蛋白酶依赖的次黄嘌呤脱氢酶诱导的自由基损伤，以及拮抗钙超载和细胞膜损伤，维持NF-kB凋亡抑制信号等使细胞免于凋亡。

本研究结果显示：在肾缺血再灌注损伤后，与传统的肾保护药物依那普利相比，中剂量rhKD／APP组在调节大鼠血清 MDA、NO含量及上调SOD、GSH-PX活性的作用与依那普利相当，但增加rh-KD／APP至大剂量后，其调节作用优于依那普利。因此可证实大鼠肾缺血再灌注损伤时清除自由基的作用源于rhKD／APP。据此可以认为rhKD／APP可通过清除自由基的途径保护肾脏。rhKD／APP各剂量组的凋亡指数均显著少于模型组（P＜0.05），提示延迟肾细胞凋亡为rhKD／APP在缺血再灌注损伤过程中保护肾脏的途径之一。肾缺血再灌注为复杂的病理生理过程，本研究证实rhKD／APP可能通过促进自由基清除及延迟肾组织细胞的凋亡对肾缺血再灌注损伤起到器官保护作用，目前尚无rh-KD／APP对再灌注损伤大鼠保护作用的其他方面机制的研究，其进一步深入的研究必将对肾缺血再灌注损伤的保护有所裨益。

［1］贺巾超，杨莉莉，马 杰，等.rhKD／APP大规模发酵及纯化工艺研究［J］.吉林大学学报：医学版，2006，32（2）：278.

［2］韩树海，崔常雷，张馨木，等.rhKD／APP对肾脏缺血在灌注损伤大鼠的肾保护作用［J］.中国实验诊断学，2008，12（9）：1105.

［3］李广宇，周 南，王利民，等.小鼠急性缺血-再灌注肾损伤模型的建立及体会［J］.岭南现代临床外科，2005，5：（4）：308.

［4］陈 敏，郭仁寿，陈重义，等.肾缺血再灌注损伤中氧自由基与细胞凋亡［J］.实用儿科临床杂志，1999，14（5）：283.

［5］Mark D.Okusa：The inflammatory cascade in acute ischemic renal failure［J］.Nephron，2002，90：133.

［6］夏安周，邢淑华，张昭犁.大鼠肾缺血再灌注过程中脂质过氧化损伤的实验研究［J］.徐州医学院学报， 2004；24（2）：109.

［7］廖红军，陈香美，崔世雄，等.缺血性肾损伤中细胞凋亡的初步观察［J］.中华医学杂志，1994，74（10）：629.

［8］傅耀文，张文岚，周洪澜，等.急性肾缺血再灌注损伤氧化侵袭与细胞凋亡［J］.中国老年学杂志，2005，25（5）：543.

1007－4287（2012）02－0214－02

2011－05－16）