旋毛虫A200711蛋白的原核表达、纯化及其对H7402细胞增殖的影响

李慧萍，刘 学，张馨月，郭 恒，赵丽晶，刘 攀，孙树民，褚丽新，刘 娟，刘明远＊，王学林＊

（吉林大学1.人兽共患病研究所，吉林 长春 130062；2.白求恩医学院）

旋毛虫A200711蛋白的原核表达、纯化及其对H7402细胞增殖的影响

李慧萍1，刘 学1，张馨月1，郭 恒1，赵丽晶2，刘 攀1，孙树民1，褚丽新1，刘 娟1，刘明远1＊，王学林1＊

（吉林大学1.人兽共患病研究所，吉林 长春 130062；2.白求恩医学院）

目的 原核表达旋毛虫抗肿瘤基因A200711，并纯化该蛋白，CCK-8检测其对H7402人肝癌细胞的生长抑制作用。方法PCR获得A200711基因片段，构建重组表达载体pET-28a（＋）-A200711，转入大肠杆菌Rosetta（DE3）。SDS-PAGE及Western blot检测IPTG诱导后重组菌，采用Ni-NTA亲合层析柱纯化并柱上复性目的蛋白。细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）检测A200711蛋白对H7402细胞的生长抑制作用。结果成功构建了原核表达载体pET-28a（＋）-A200711，目的蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达；SDS-PAGE及 Western blot分析显示，相对分子量约22KD处出现目的蛋白条带，与理论值相符；经Ni-NTA亲合层析柱获得了高纯度可溶性的A200711蛋白；H7402细胞增殖抑制率与A200711蛋白浓度存在量效关系，同时随作用时间的延长增殖抑制率也明显增加。结论成功克隆、表达并纯化了旋毛虫A200711蛋白。A200711蛋白可抑制H7402细胞的增殖，且呈现时效和量效关系，本研究表明旋毛虫A200711蛋白作为潜在的抗肝癌生物制剂有进一步研究的价值。

book=195,ebook=83

旋毛虫；抗肿瘤；A200711基因；原核表达

（ChinJLabDiagn，2012，16：0194）

旋毛形线虫（Trichinellaspiralis，Ts.）引起的旋毛虫病是一种呈世界分布的人兽共患寄生虫病。该虫是一种食源性人兽共患寄生虫，可感染人及150多种动物，对人畜危害很大。感染旋毛虫的病人出现持续性高热、肌肉疼痛、面部浮肿等症状［1，2］。旋毛虫肌幼虫寄生于肌纤维内，一般形成包囊，研究发现旋毛虫包囊的形成过程类似于宿主肌细胞在凋亡调控下的细胞修复过程，并且肿瘤细胞的凋亡信号调控机制与旋毛虫包囊形成机制非常相似［3］。Apanasevich VI发现长期感染旋毛虫肌幼虫的雌Swiss鼠的乳腺癌的发生率明显低于未感染鼠［4，5］。吉林大学王学林等研究发现旋毛虫虫体粗蛋白对H7402细胞体外有明显抑制作用，褚丽新等发现旋毛虫A200711基因真核转染后对H7402细胞有促凋亡作用［6］，因此旋毛虫体内可能存在调控肿瘤细胞凋亡的未知蛋白。本研究利用实验室前期从旋毛虫成虫的T7噬菌体展示文库中钓取到能够与人肝癌细胞（H7402）和人白血病细胞（K562）结合的一致DNA序列A200711设计引物，以旋毛虫成虫cDNA为模板PCR扩增全长A200711基因，构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达了C端带有6×His标签的A200711重组蛋白，并利用Ni-NTA亲合层析柱对表达产物进行了纯化和柱上复性，CCK-8试剂盒检测A200711蛋白对人肝癌细胞H7402增殖的影响，为该基因的抗肿瘤功能研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

旋毛虫cDNA文库，大肠杆菌菌株JM109，原核表达载体pET28-a（＋），DE3菌株，旋毛虫感染猪26天血清均由本实验室保存，羊抗猪二抗为santa公司产品；限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ为MBI产品；pMD-18T载体、T4DNA连接酶和Taq DNA聚合酶为Takara公司产品；DNA片段纯化回收试剂盒和质粒抽提试剂盒为Axygen公司产品。Ni-NTA亲合层析柱购自GE公司；苯甲基磺酰氟（PMFS）、L-精氨酸、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、还原型谷胱甘肽（GSH）均为SIGMA公司产品；人肝癌细胞H7402购于中国科学院生化细胞所，CCK-8试剂盒为日本同仁化学产品。

1.2 方法

1.2.1 pMD-18T-200711克隆载体的构建 根据已获得的A200711基因的核酸序列设计引物P1（CGC GGA TCC CTG ATG ACA TCT AAT GAA TTT）及 P2（TTA CTC GAG ATC AGA CAA TGT TGG TGA CAC CTT），上下游酶切位点分别为BamHⅠ和XhoⅠ（下划线部分）。以旋毛虫cDNA为模板，P1、P2为引物，PCR扩增目的片段，反应条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30 s，72℃45s，30个循环；72℃5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒回收目的片段。T4连接酶催化，回收片段与BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后线性的pET-28a（＋）载体连接，再转化至感受态大肠杆菌（Rosetta）DE3，涂硫酸卡那霉素平板，37℃过夜培养。筛选阳性菌挑取单菌落接种于5ml LB培养基（含50mg／L硫酸卡纳霉素）试管中，37℃震荡过夜。收集菌体提取质粒DNA，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定并进行序列测定（序列测定由华大中天生物技术有限公司完成）。

1.2.2 旋毛虫A200711蛋白的诱导表达、鉴定 取鉴定正确的重组菌5μl接种于5ml LB培养基中37℃过夜培养，取对数生长的大肠杆菌以1%的浓度接种于1L抗性LB中，当OD600达到0.4－0.6时（约3h）加入终浓度为1mM IPTG 37℃表达6h后进行Western blot鉴定，一抗为旋毛虫26天阳性血清，二抗为羊抗猪抗体（1∶5 000）。

1.2.3 A200711抗肿瘤蛋白的分离纯化 1L菌液4℃3 000rpm，离心30min，沉淀用40ml PBS重悬，反复冻融三次后超声破碎（工作5s，间歇4s，全程1h）。4℃10 000r／min，30min离心超声后样品，沉淀为包涵体，用Buffer A［2M 尿素2%Triton X-100（v／v），0.1mM PMSF］反复洗三次后重悬于Buffer B（20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，20 mM 咪唑，0.5ML-精 氨 酸，1mM GSH，1mM GSSG，pH 7.4）5ml，4℃过夜。上清16 000rpm 4℃离心15min，最后经0.22μm过滤后为待纯化样品。用快速蛋白液相色谱仪（FPLC，ÄKTA，GE）按照GE公司提供的操作说明书进行柱上纯化复性。

图1 A200711基因PCR结果

图2 双酶切鉴定结果

1.2.4 A200711蛋白对H7402细胞增殖的影响人肝癌细胞株H7402分别置于含10%胎牛血清，青、链霉素各100UI／ml的DMEM培养液中，37℃，5%CO2培养箱内培养，每2d换液，取对数生长期细胞进行实验。消化贴壁培养的细胞，制备单个细胞悬液，计数5×103个于96孔板。每个样品设置3个平行孔，培养24h，更换培养液，分别加入终浓度为2.5，5.0，7.5，10.0，12.5μg／ml的 A200711蛋白，培养24、48、72h后吸弃上清。用DMEM培养液缓慢冲洗孔板2次后，每孔加入DMEM培养液100μl，后加入10μl的CCK-8试剂，同时设无蛋白组为阴性对照，无细胞无蛋白组为空白孔。继续培养1h后用酶标仪测定吸光度（A）值，测定波长为450nm。根据细胞存活率评价不同浓度A200711蛋白对细胞生长的影响，结果按以下公式计算：细胞存活率（%）＝（实验组A均值－空白孔A值）／（对照孔A值－空白孔A均值）×100%。

2 结果

2.1 pET-28a（＋）-A200711表达载体的构建

PCR产物电泳显示，大约在450bp处出现目的条带，与预期大小相符，见图1。目的片段连接到pET-28a（＋）载体后提质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切可见目的条带（图2），测序结果显示成功构建表达载体pET-28a（＋）-A200711。

2.2 旋毛虫抗肿瘤蛋白的诱导表达及鉴定

1L菌液在1mM IPTG条件下诱导表达不同的时间（0、2、4、6、8h），取10μl菌液进行 SDSPAGE电泳，与未加IPTG诱导的菌液比较，在约21KD处出现目的条带，Bandscan 5.0凝胶图像分析软件显示，IPTG诱导6h时蛋白表达量最高，目的蛋白达菌体总蛋白的35.8%，见图4。Western blot结果显示，在约22KD大小处出现一条与理论相符的阳性条带，见图3。

图3 Western blot结果

图4 亲和层析法纯化结果

2.3 旋毛虫抗肿瘤蛋白的分离纯化

经Ni-NTA亲和层析柱过滤后分离得到分子量为21KD的纯化蛋白，通过梯度柱上复性可见洗脱下来单一的目的峰，洗脱下来的目的蛋白经过3KD超滤管可以起到进一步的纯化效果，见图4。

2.4 CCK-8检测A200711蛋白对H7402细胞增殖调节作用

A200711蛋白对体外培养的肝癌细胞H7402的活力影响见图5。结果表明，5.0μg／ml的A200711蛋白可明显抑制细胞增殖（P＜0.05），在48h时的抑制率为27.35±1.12%，且细胞抑制率随着剂量的增加而增加。

图5 A200711蛋白对H7402细胞增殖抑制作用

3 讨论

寄生虫和宿主细胞的共生使得寄生虫也参与到宿主细胞的分化和凋亡信号传导过程中。由于旋毛虫包囊的形成，宿主卫星细胞的分化过程中也涉及到细胞凋亡和抗凋亡的机制。感染旋毛虫的骨骼肌细胞的细胞周期会停滞在G2／M期，同时骨骼肌细胞的特有基因表达水平均降低［7］。近年有研究表明旋毛虫感染后会引起卫星细胞中c-Ski肿瘤抑制因子表达量的上调［8］。Boonmars等发现在包囊形成过程中线粒体凋亡途径相关因子Bax、Apaf-1、Caspase 9表达上升，同时死亡受体途径相关因子TNF-ɑ、TNFR I、Caspase 8和Caspase 3表达上调。说明旋毛虫分泌物有可能通过以上两条途径诱导感染细胞发生凋亡［9］。

本研究所采用的pET 28a（＋）载体是pET系统中应用最广泛的一员，具有2个6＊His标签可以自行选择将His标签加在目的蛋白的N端或C端，可以采用镍柱进行纯化，操作简便成本低廉。实验采用的宿主菌Rosetta（DE3）是BL21的衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子对应的tRNA，明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制，提高了真核生物基因的表达水平。本研究结果表明，纯化复性后的A200711蛋白对H7402细胞增殖有明显的抑制作用，且抑制作用呈现剂量-时间效应关系。细胞增殖的反向选择就是细胞死亡，细胞增殖和死亡之间微妙的平衡似乎都是通过细胞增殖刺激物导致细胞程序性死亡或凋亡的激活来进行调节［10，11］。细胞凋亡在肿瘤细胞的生存过程中扮演着关键角色，是当今最热门的研究课题之一。本研究通过CCK-8检测发现：A200711蛋白对H7402肝癌细胞生长抑制具有显著的剂量效应关系。A200711蛋白可能通过对细胞凋亡的诱导，在一定程度上对H7402肝癌细胞增殖进行抑制，为以后旋毛虫抗肿瘤的机理研究提供了客观的实验数据。

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Effect on proliferation of H7402cell treated with A200711protein from Trichinella spiralis by prokaryotic expression and purification

LIHui-ping，LIUXue，ZHANGXin-yue，etal.（InstituteofZoonosis，JilinUniversity，Changchun130062，China）

ObjectiveA200711protein fromtrichinellaspiraliswas expressed and purified in E.coli Rosetta（DE3）.Growth inhibition of H7402human liver cancer cells co-cultured with A200711protein was detected by CCK-8.MethodsIn order to express A200711gene in E.coli，the PCR product of 457bp A200711fragment was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a（＋）with BamHⅠand XhoⅠ，The recombinant pET-28a（＋）-A200711then was transferred into E.coli Rosetta（DE3），induced by IPTG，purified and renatured by Ni-NTA affinity column chromatography，detected by SDS-PAGE and Western blot.Growth inhibition of H7402cells treated with the purified A200711protein was analysised by Cell Counting Kit-8.ResultsProkaryotic expression vector of pET-28a（＋）-A200711was constructed successfully，the protein were expressed as inclusion bodies in E.coli after induction with IPTG；SDS-PAGE and Western blot analysis detected the protein at molecular weight of about 22kD.High-purity soluble A200711protein were harvested by Ni-NTA affinity chromatography；CCK-8assay have revealed that A200711had the inhibitory effect on cell proliferation（P＜0.05）.ConclusionTrichinella A200711protein was expressed and purified successfully.These results demonstrate that A200711had the inhibitory effect on H7402cells proliferation and valuable biologics in againsting hepatoma.

Trichinella spiralis；anti-tumor；A200711；prokaryotic expression

1007－4287（2012）02－0194－04

国家自然科学基金资助（30972177）

＊通讯作者

R737.5；Q786

A

2011－07－14）